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小盐芥ThPP1基因增强了转基因水稻的耐碱性

何蕊  
【摘要】:在盐碱胁迫条件下,无机焦磷酸化酶对植物体内的离子及可溶性小分子的运输具有重要的调节功能。本试验将小盐芥无机焦磷酸化酶ThPP1基因转入水稻中,探究碱胁迫下ThPP1基因在转基因水稻中的调控作用,明确ThPP1基因响应抗逆胁迫的分子机制,为培育抗逆的分子育种提供理论依据与材料支撑。生物信息学分析表明,小盐芥ThPP1基因的开放阅读框为900 bp,编码300个氨基酸,分子量约为33.5kDa(登录号:KC250018.1)。ThPP1基因蛋白无跨膜结构,拥有紧凑的单域结构,其保守域序列与拟南芥无机焦磷酸化酶保守域序列具有高度同源性。亚细胞定位试验表明,ThPP1蛋白定位在细胞溶质内,属于可溶性的无机焦磷酸化酶,这与PPase Ⅰ家族蛋白结构一致。碱胁迫下小盐芥ThPP1基因表达模式分析显示,随碱胁迫的加剧小盐芥ThPP1基因表达量明显升高,这说明小盐芥ThPP1基因受碱胁迫诱导。为验证ThPP1基因在应对碱胁迫时的生理功能,将小盐芥ThPP1基因转入水稻品种kitaake中,获得转基因水稻株系,并对碱胁迫条件下转基因及野生水稻的各项生理指标进行测定。结果表明:碱胁迫条件下,转基因水稻的生物重、叶片中蔗糖和淀粉含量显著高于野生型株系,叶绿素含量和光合速率也显著高于野生型株系;分析水稻的渗透调节能力和维持离子平衡能力的试验发现,碱胁迫下,转基因水稻体能累积更多降低植物渗透势的有机渗透调节物质和减少了细胞膜损伤,保证了水分的正常吸收,维持了植株体内的离子平衡;转基因水稻中较低的钠钾比减轻了碱胁迫下Na+的毒害。进一步研究发现,在碱胁迫下,转基因水稻中ThPP1基因的表达引起了水稻内源基因的差异表达,这些基因的差异表达主要影响植物细胞组分氧化还原过程和代谢过程,改变了植物的代谢途径和次生代谢物合成途径。为研究ThPP1参与植物耐碱性生理调控的分子机制,利用分裂泛素酵母双杂交系统初步筛选到小盐芥ThPP1的1个互作蛋白:16#。生物信息学发现,16#与LHCB6蛋白同源性较高,可初步断定16#主要参与小盐芥的光合作用。因此,ThPP1基因可能以互作的方式在植物光合作用中发挥作用。采用CRISPR/Cas9基因编辑技术,对与ThPP1基因具有高度同源性的水稻体OsPP1基因进行定点突变,共获得4种不同突变形式的植株:A插入、3、21、47个碱基缺失。CRISPR/Cas9基因编辑系统将水稻OsPP1基因的成功敲除为科学评价水稻无机焦磷酸化酶OsPP1基因、通过再导入外源同源体基因如小盐芥ThPP1基因评价其生理生化功能提供了一条有效的方法途径和重要的材料支持。


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