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水稻不育突变体ohms1、difo1和strs1的鉴定、基因定位与功能分析

孙廉平  
【摘要】:水稻花发育标志着水稻从营养生长阶段转向生殖生长阶段,是关乎水稻繁衍后代和产量形成的关键过程;利用水稻花器官发育和雄性不育突变体研究水稻生殖发育的相关调控因子及其作用机理,一直都是水稻生物学研究的重点和热点。本研究针对两个花发育畸形的不育突变体(ohms1和difo1)进行了表型分析和基因精细定位,并对一个雄性不育突变体strs1进行了表型分析和图位克隆,在此基础上初步阐明了异胡豆苷合成酶基因OsSTRS1调控水稻花药和花粉发育的作用机制。主要结果如下:1、对ohms1的研究:开颖不育突变体突变体ohms1(open hull and male sterile 1)颖花开裂,在雄蕊和柱头之间形成类似内外稃的结构,使得突变体的颖花形成类似“三齿稃”状的三个颖壳,小穗完全不育,花粉育性为60%-70%,但自交不结实。遗传分析和基因定位结果表明,ohms1受一对隐性单基因控制,位于第3染色体短臂KY2和KY29标记之间,物理距离约42 kb,该区域包含4个开放阅读框ORFs。进一步序列分析发现,突变体中一个编码MADS盒的基因LOC_Os03g11614的第5内含子末位碱基由A突变为G。酶切实验和cDNA测序证实,该基因的第5内含子未被剪切,致使该基因的第6外显子所编码的14个氨基酸完整缺失,但并未造成该蛋白MADS结构域的改变或移码。qRT-PCR结果显示,突变体中OsMADS1基因的表达水平显著降低,水稻开花调控因子和内外稃发育调控基因的表达量也发生了显著变化。说明该基因对水稻花器官发育尤其是内外稃发育和小花原基的分化具有重要作用。2、对difo1突变体的研究:与野生型相比,difo小花的外轮花器官基本正常,但其内轮花器官,诸如雄蕊、柱头及浆片数目均发生了变化,不具备正常的花丝和可育花粉。绝大多数difo1小穗的柱头数目呈现不同程度的增加,且附生在花药和膨大的类似胚珠的细胞团上,而不仅仅是在胚珠上。半薄切片和扫描电镜观察结果显示,difo1的内轮花器官数目极不稳定且早期小穗发育显著异常,小花内的花药表面光滑而非野生型花药表面的网状,最终不能形成成熟花药而导致突变体小穗不育。此外,difo花时延迟、开花习性显著异常、张颖角度缩小且花药不伸长。遗传分析结果表明,difo的突变表型受一对隐性核基因控制,位于第4染色体短臂S22与RM16439两个标记之间的54-kb区间内,该区间包含9个开放阅读框。测序分析结果显示,在该区间内的一个锌指蛋白类基因(LOC_Os04g08600)的启动子区存在一个单碱基缺失。此外,qRT-PCR结果显示,DIFO1基因、许多水稻花器官调控因子在突变体内轮花器官中的表达量显著降低。综上所述,DIFO1基因是水稻花器官发育和小穗发育的一个关键调控因子,尤其可能在水稻内轮花器官分生组织的属性和花序原基的形成过程中起关键作用。3、对OsSTRS1基因的图位克隆:strs1突变体营养生长、小穗结构与野生型中恢8015基本一致,但花药瘦小且呈乳白色、花粉完全典败。花药半薄切片结果显示,strs1突变图与野生型相比,绒毡层降解延迟,有丝分裂时期小孢子明显皱缩且不规则排布,花药内室的内容物皱缩、只存在单核花粉;电镜观察等结果进一步证实,突变体的花药外壁排布致密但混乱、内壁孢粉素和乌氏体残留明显,花粉外壁皱缩干瘪、近乎“自噬”细线化,花粉内室不含淀粉粒等充实物。由此可证实,strs1突变体是由于花药绒毡层发育畸形导致后期营养营养供给不均衡,最终导致花粉完全败育。通过图位克隆将STRS1不育基因精细定位至水稻第3号染色体短臂上介于分子标记JS6和JS7之间的20kb物理区间内。测序结果显示,其中一个异胡豆苷合成酶基因(Os03g0263600)的第四个外显子出现了两个碱基的缺失,导致mRNA的移码和最终蛋白翻译的提前终止。RNAi和功能互补实验证实OsSTRS1就是控制该突变体花粉败育表型产生的基因。对该基因的进化分析显示:OsSTRS1与玉米雄性不育基因ZmMS45基因亲缘关系最近。表达分析结果显示,该基因在水稻主要在花药和花粉发育的有丝分裂时期表达、且在花药内外壁和花粉外壁高表达,许多花药发育相关基因的表达也受到了显著影响;对突变体和野生型花药的化学成分分析结果也显示,突变体内的角质和蜡质成分显著低于野生型。对该蛋白的亚细胞定位结果显示,OsSTRS1在水稻原生质体的质膜上分布,去除该蛋白前段的跨膜区之后,其功能结构域均定位于细胞核。本研究为进一步研究异胡豆苷合成酶类基因在水稻花药发育和花粉外壁形成过程中的调控机制和生物学功能提供了基础。


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