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大白菜核基因雄性不育突变体ftms的鉴定

谭翀  
【摘要】:雄性不育广泛存在于高等植物中,对于具有显著杂种优势的十字花科蔬菜作物,雄性不育系的利用是配制杂交种的重要手段之一,因此,雄性不育性的研究一直受到育种专家的高度重视。由于自然突变的雄性不育材料较为稀少,利用人工诱变创制雄性不育材料,已经成为雄性不育研究的重要手段。大白菜(Brassica campestris ssp.pekinensis)是十字花科芸薹属的重要作物,杂种优势十分显著。本研究利用大白菜小孢子培养获得的DH系‘FT’为试材,利用60Co-γ射线诱变与游离小孢子培养相结合的方法,创制出1份雄性不育突变体ftms;采用图位克隆策略,并参考高通量测序结果,对突变基因ftms进行了鉴定,主要研究结果如下。1.大白菜雄性不育突变体ftms的表型特征和遗传特性以突变体ftms为母本,与其野生型‘FT’杂交,配制F1和F2。遗传分析结果表明,突变体ftms的雄性不育性由单隐性核基因控制。突变体ftms与野生型‘FT’在营养生长阶段无明显差异,在生殖生长阶段突变体ftms花药退化,无花粉。石蜡切片观察发现,突变体ftms雄蕊败育始于小孢子四分体时期,绒粘层细胞异常膨大且高度液泡化导致小孢子发生败育。2.基于BSR-Seq的突变基因ftms初步定位以开白花的突变体ftms为母本,开黄花的白菜薹DH系‘14S701’为父本,构建F2分离群体。F2群体中共有4种表型:黄花可育、黄花不育、白花可育及白花不育。遗传分析结果表明,雄蕊育性与花瓣颜色2个性状均由单隐性核基因控制,且为独立遗传。选取黄花可育与白花不育2种表型植株各50株,构建2个RNA混池。通过BSR-Seq分析,同时定位了雄蕊育性和花瓣颜色2个基因,在A05和A02染色体上获得了与目标性状连锁的候选区间。通过在候选区间内进一步开发SSR连锁标记进行验证,将突变基因ftms定位于A05染色体,白花基因定位于A02染色体。3.基于F2大规模分离群体连锁分析的突变基因ftms精细定位利用F2大规模分离群体中的2,600株雄性不育植株进一步缩小定位区间,最终将突变基因ftms定位于A05染色体的In Del20和In Del14标记之间,遗传距离分别为0.02c M和0.06c M。经与大白菜参考基因组(v1.5)比对,目标区间约1.7Mb,共有114个基因。由于定位区域位于A05着丝粒附近,造成重组困难,已无法进一步缩小定位区间。4.基于全基因组重测序的候选基因预测对突变体ftms及其野生型‘FT’进行了全基因组重测序,利用重测序信息对突变体ftms的突变位点进行了检测。在定位区间内突变体ftms上检测到纯合SNP和In Del突变位点82个,其中,在外显子上只有1个错义的SNP突变,所在基因编号为Bra010198,编码β-(1,3)-半乳糖基转移酶,其拟南芥同源基因AT1G33430参与花粉外壁形成。突变体ftms的Bra010198基因第5个外显子上发生了G→T的碱基颠换,导致其蛋白质保守结构域中281th氨基酸Gly(GGG)变为Val(GTG)。q RT-PCR分析结果表明,候选基因Bra010198在雄蕊中特异性表达。5.候选基因Bra010198家族成员鉴定以拟南芥已鉴定出的20个β-(1,3)-半乳糖基转移酶家族基因的蛋白序列为参考,在大白菜基因组中共筛选出30个β-(1,3)-半乳糖基转移酶家族基因。大白菜β-(1,3)-半乳糖基转移酶家族基因与其拟南芥同源基因具有较好的共线性关系。系统进化分析将大白菜β-(1,3)-半乳糖基转移酶家族基因分为2个分支:group I和group II。理化性质、保守motifs和外显子/内含子数目在各分支家族成员中相对一致。6.基于RNA-Seq的雄性不育突变体ftms转录组分析利用RNA-Seq技术,对突变体ftms与野生型‘FT’的花蕾进行了比较转录组分析,共检测到2,305个差异表达基因。与绒粘层发育相关的基因AMS、与胼胝质合成相关的基因CALS5和CDKG1、与原外壁合成相关的基因RPG1、以及与花粉壁合成相关基因家族,包括3个AGPs、13个PLs、25个PMEs、7个PMEIs和18个PGs,在突变体ftms中均下调表达。经GO和KEGG功能富集分析,发现与花粉及花粉管发育、细胞及花粉壁、糖类代谢和脂类代谢有关的GO terms被显著富集。发现了7个与糖类代谢和脂类代谢有关的pathways被显著富集。推测突变体ftms中β-(1,3)-半乳糖基转移酶基因Bra010198的突变,通过影响AGPs的合成,进而导致绒粘层、胼胝质、原外壁以及果胶代谢异常而造成雄蕊败育。


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