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几种高效表达载体的构建及基于宏基因组库改造pfLamA葡聚糖酶的研究

高何瑞  
【摘要】:分子克隆是生物技术、遗传学、制药、蛋白质生物化学、结构生物学等领域的重要基础。近年来,随着下一代测序技术(Next-generation sequencing,NGS)的快速发展和应用,产生了大量的基因组信息。为了在功能研究中分析和利用这些重要的基因组信息,需要有效的分子克隆和蛋白质表达工具。现有的克隆和表达载体在克隆效率、表达方式和蛋白纯化方式等方面仍需进一步改进。为此,本研究设计和构建了一系列新型质粒载体,为解决上述难题提供了重要的工具。本研究采用新构建的质粒对激烈火球菌β-1,3-内切葡聚糖酶(pf LamA)基因和里氏木霉内切木聚糖酶(Hj-Xyn)基因进行了分子克隆、异源表达和蛋白纯化。同时还利用新构建载体,通过宏基因组区段改组的方式,对pfLamA进行了分子改造。首先,为了解决现有pET载体克隆效率不够高、容易出现假阳性、克隆位点的选择不够灵活等问题,本研究构建了一种迷你型的新质粒载体pANY2。该载体利用ccdB为负筛选标记,具有更高的克隆效率,而且假阳性率很低。此外,该载体的多克隆位点可以同时满足粘性末端克隆、平末端克隆和重组酶克隆的需要。更重要的是,该酶切位点还含有特殊设计的AhdI酶切位点,可以在实验室自制T载体,进行无背景的TA克隆。另外,该质粒还有T7启动子和组氨酸标签,可以满足蛋白质高效表达和纯化的需要。同时具备上述多种特征,属于国内外首创,这也决定了本质粒具有广泛的应用前景。第二,为了解决目前温度诱导型质粒的克隆效率低的问题,本研究构建了一种包含cIts857-pR/pL温敏调控原件的新质粒载体pANY3,既能显著提高克隆的效率,又可以实现温度诱导型蛋白表达。同时本研究还进一步分析了诱导温度对蛋白质表达水平和酶活力的影响,结果表明,诱导温度对于不同的蛋白的表达水平的影响差异非常显著,因此对诱导温度的优化十分必要。以往研究中多采用42℃固定温度进行诱导表达,而本研究结果对于纠正这一做法有重要的参考价值。第三,现有的表达载体都只能进行单向表达,对于固定的目的基因来说,一次克隆步骤最终只能得到一个目标重组质粒。本研究构建了一种新型的双向表达质粒,可以通过TA克隆同时获得两个目标重组质粒。这两个目标重组质粒中的目的基因的插入方向相反,在不同的启动子作用下,可以分别实现IPTG诱导表达或温度诱导表达。这样既可以一步平行获得两个克隆,还可以方便的比较两种表达系统对同一个基因的表达效率。这种双向表达载体属于国内外首创,也对相关的研究具有重要的参考价值。第四,常用的基于组氨酸标签的重组酶纯化方法具有成本高的缺点,另外咪唑的使用也常常影响到酶活性。本研究构建了一种新的质粒载体pANY6,既可以进行高效的分子克隆,又可以采用简单的盐沉淀方法实现重组蛋白的纯化。该质粒含有具有自断裂功能的内含肽(Intein)及类弹性蛋白(ELP)的融合标签标签,利用ELP标签可通过沉淀步骤分离融合蛋白,并通过内含肽切去ELP标签。另外,本研究还探索了将ELP沉淀纯化过程与尿素变性、复性纯化包涵体过程相偶联,这样就能够有效避免了传统透析法除尿素的耗时操作。采用这种简便的偶联策略进行pfLamA纯化,最终纯化浓度提高近3倍,而总酶活提高近50%。这一研究结果对于不溶性的重组蛋白的纯化具有特别重要的意义。第五,本研究还采用新构建的克隆载体,采用宏基因组区段改组的方式,对pf LamA进行了分子改造。通过宏基因组16s测序,确定土壤样品的微生物组成,在此基础上通过pfLamA保守区设计简并引物,通过PCR从土壤基因组中获取与pfLamA具有同源性的DNA片段,通过重叠延伸重组全长基因,然后连接到质粒载体上构建突变体库,并进行活性筛选。这种宏基因组区段改组的方法在国内外未见报道,因此,本研究为土壤微生物酶的分子改造提供新思路,同时也验证了新型表达载体在构建突变库方面的有效性。综上所述,本研究设计和构建了一系列新型质粒载体,并在此基础上实现了pf LamA和Hj-Xyn的分子克隆、异源表达、蛋白纯化,和基于宏基因组改组策略的蛋白分子改造。这些新的质粒载体及其相关的研究方法对于同类研究具有非常重要的参考价值,并有望在生物科学、生物技术、农业和食品等领域具有广泛的运用前景。


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