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北黄海海泥沉积物放线菌种群分析及活性菌株研究

闫建芳  
【摘要】:本文采用16S rDNA V3可变区变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术,对北黄海不同功能区海泥沉积物中的细菌种群差异进行了比对研究,对样品中可培养放线菌采用组合培养方式进行了分离,揭示了海洋样品中放线菌的丰富度和差异性;为进一步开发利用海洋放线菌资源,分别从挥发性气体、固体培养代谢物和发酵液代谢产物入手,筛选到3株抗菌功能不同的海洋放线菌,对其分别进行菌种鉴定及挥发性抑菌组分、固体培养活性产物和液体发酵产物的研究,从不同角度为放线菌资源开发利用提供借鉴。主要研究结果如下:1.明确了北黄海不同功能区划间细菌种群差异性及主要影响环境因子采集北黄海8个功能区的海泥沉积物,通过PCR-DGGE技术测定分析不同样品内细菌的种群数量及优势类群。DGGE条带数从18~26不等,反映出了样品中存在的主要代表类群。聚类分析表明所有样品聚类为3群:丹东盐场附近样品(Y1)为I群,丹东保护区和大连养殖区样品(Y2、Y4、Y5、Y6)为II群,大连小窑湾码头附近(Y3)和浴场海域的样品(Y7、Y8)为III群。对特征条带测序分析表明,所有海泥样品中普遍存在的优势菌为γ变形杆菌门的阿氏埃希氏菌Escherichia albertii和噬甲基菌属Methylophaga未定种菌株。在丹东保护区海泥沉积物(Y2)中存在拟无枝酸菌属Amycolatopsis、棕囊藻杆菌属Phaeocystidibacter和盐坑微菌属菌株Salinimicrobium gaetbulicola。养殖区(Y4、Y5和Y6)存在优势菌为拟杆菌门盐坑微菌属Salinimicrobium未培养新种和β变形杆菌门亚硝化螺菌属氨氧化细菌Nitrosospira multiformis。而在浴场海域样品(Y7和Y8)未检测到独特的优势菌群存在。细菌种群多样性指数(丰富度S、香农指数H’和均匀度E_h)分析表明,各功能区海泥中主要细菌种群丰富度差异较小,香农指数介于2.41~3.10之间,均匀度介于0.835~0.985。菌群结构与环境因子的RDA分析表明,pH、总碳和总氮是细菌群落组成与结构动态的重要驱动因子,腐殖酸含量对细菌群落多样性影响不大。2.明确了北黄海放线菌主要类群并筛选到3株优良活性菌株采用8种培养基对8个位点海泥样品进行分离,获得145株放线菌。其中,链霉菌114株,占78.6%;其他放线菌31株,占21.4%。稀有放线菌主要包括:伦茨氏菌属Lentzea、短杆菌属Marinobacter、微杆菌属Microbacterium、小单孢菌属Micromonospora、涅斯捷连科氏菌属Nesterenkonia、拟诺卡氏菌属Nocardiopsis、野野村菌属Nonomuraea、假诺卡氏菌属Pseudonocardia和糖丝菌属Saccharothrix等。从放线菌整体分离及环境因子测定结果来看,养殖区放线菌数量差别较大,原因可能是较高的pH及养殖种类、投放饵料及抗菌药物等对放线菌数量及类别产生了影响;Y1盐场周边位点的放线菌检出率最低,表明极端环境对放线菌种类影响密切。从稀有放线菌检出率来看,M1培养基、GH培养基、SC和ISP5培养基组合分离等达到最佳效果。对分离获得的部分放线菌从挥发性气体代谢产物、固体培养产物和液体发酵产物方面分别进行常见靶标菌抑菌活性测定,筛选出抑菌效果较好的3株放线菌HW80、HW85和GQ-17,据此对其分类地位及代谢产物等开展进一步研究。3.鉴定明确了菌株HW80分类地位及其挥发性代谢产物组分结合16S rDNA序列分析、形态观察和生理生化反应的鉴定结果,菌株HW80与达松维尔拟诺卡氏菌达松维尔亚种(Nocardiopsis dassonvillei subsp.dassonvillei DSM43111~T)亲缘关系最近,序列相似度达99.93%,培养形态特征及生理生化反应一致,鉴定为Nocardiopsis dassonvillei HW80。抑制真菌活性测定表明,HW80的挥发性代谢产物抑菌能力较强,对除玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)外的9种供试植物病原菌均有抑制作用,可导致丝状真菌菌丝尖端膨大,从而影响其正常生长。采用顶空固相微萃取气相质谱联用(HS-SPME-GC-MS)技术对HW80挥发性气体成分分析,证明含有33种化合物,其中醇类9种,烷烃类9种,烯烃类6种,酮类3种,酸类2种。其主要成分为3-壬醇(21.25%)、3-甲基-4-羰基戊酸(16.99%)、1,4-二噻烷-1-氧(10.81%)、3-亚甲基-对-薄荷-8-烯(7.65%)、甲烷磺酸(5.63%)、二甲醚(5.36%)等6种化合物。4.明确了菌株HW85分类地位及固体培养代谢产物的抑菌成分经16S rDNA序列分析,菌株HW85与酒红土褐链霉菌(S.vinaceusdrappus NRRL2363~T)等多株模式菌相似度均为99.93%,辅助形态特征及生理生化反应结果最终将其鉴定为酒红土褐链霉菌S.vinaceusdrappus HW85。采用菌饼法测定,菌株HW85固体培养物对病原真菌具有广谱抑菌活性。经改良淡水培养基(可溶性淀粉20g,KNO_3 1g,K_2HPO_4 0.5g,MgSO_4 4.11g,琼脂15g,去离子水1L,pH 7.2~7.4)培养,采用乙酸乙酯萃取固体培养物获得活性代谢产物粗品。理化性质研究表明该活性成分对温度变化不敏感,耐酸不耐碱,对紫外线不敏感,不能被蛋白酶降解。经TLC、硅胶柱层析分离可得浅黄色粗品,以254nm为检测波长,采用高效液相色谱以85%-80%-85%甲醇/水溶液为流动相,用C18反相柱进行分离和薄层色谱制备及半制备液相收集、浓缩,获得纯度为97.89%的白色粉末物质。利用UPLC-Q-TOF-MS、UV、IR及~1H NMR和~(13)C NMR等技术进行结构分析,确定分子量为913.55。查阅文献资料及相关谱图进行对比,确定其活性代谢产物分子式为C_(51)H_(79)NO_(13),不饱和度为13,化学名称为:(3S,6R,7E,9R,10R,12R,14S,15E,17E,19E,21S,23S,26R,27R,34aS)-9,10,12,13,14,21,22,23,24,25,26,27,32,33,34,34a-十六氢-9,27-二羟基-3-[(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-羟基-3-甲氧环己基]-1-甲基乙基]-10,21-二甲氧-6,8,12,14,20,26-六甲基-23,27-环氧-3H-吡啶并[2,1-c][1,4]氧杂氮杂三十一环烯-1,5,11,28,29(4H,6H,31H)-戊酮。文献检索该物质为已知三烯大环内酯类活性化合物Rapamycin。这是首次从酒红土褐链霉菌中分离到该物质。5.测定明确了菌株GQ-17的分类地位及其混合发酵产物防病促生效果经16S rDNA序列比对分析及系统发育树构建,表明菌株GQ-17与产生土霉素和龟裂杀菌素的龟裂链霉菌龟裂亚种(Streptomyces rimosus subsp.rimosus JCM4667~T)相似度为99.93%,亲缘关系最近。结合菌落形态、菌丝特征观察及生理生化反应分析,GQ-17除耐酸碱(pH 4~12)和耐高温(45℃)外,其他生理生化反应结果与模式菌高度一致。综合分析,鉴定其为龟裂链霉菌Streptomyces rimosus GQ-17。GQ-17为龟裂杀菌素和土霉素产生菌,发酵液活性物质对于植物病原真菌具有广谱抑制作用。采用与链霉菌YH-91(S.diastaticus)和YH-23(S.pactum)混合发酵方法,进行活性产物ST-2的发酵条件优化及促生防病效果验证。经单因素和正交设计试验,确定了ST-2的最佳发酵培养基为:玉米粉8 g/L、黄豆粉10 g/L、氯化钠2.5 g/L、碳酸钙2.0 g/L,pH自然。最佳发酵条件为:菌株GQ-17、HY-91和HY-23同浓度种子液分别以3:3:2比例混合后按3%体积接种于50mL发酵液(250mL三角瓶),31℃下以150r/min的转速振荡培养5 d,其发酵液对盆栽黄瓜枯萎病具有较好的防治效果,相对防效达65.89%。此外,ST-2组合发酵产物施用后,植株株高和茎粗较无菌对照分别增加29.75%和12.69%,具有明显的促生作用。


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