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玉米NAC类转录因子ZmNAC19和ZmNAC31的克隆、表达及功能初步研究

李青云  
【摘要】:NAC是高等植物所特有的一类转录因子,它在植物的生长发育、花药开裂及逆境胁迫中具有重要作用。玉米生育期内由于高温、高湿等环境因素造成花药不能开裂从而严重影响玉米产量。拟南芥中的NAC类基因不仅参与叶片的发育,还调控花药开裂。而玉米中的NAC类基因研究较少,为了研究玉米中调控叶片和花药开裂的NAC类基因,本文对玉米中的NAC类基因进行筛选,筛选出ZmNAC19基因主要在叶里面表达,ZmNAC31基因主要在雄穗和叶里面表达。将筛选出的基因进行生物信息学分析、构建GFP融合蛋白载体和过表达载体、获取过表达转基因拟南芥并进行表型分析。主要成果如下:1.通过比对拟南芥中NST蛋白序列,从玉米中筛选出100个NAC基因,又结合转录组数据,筛选出33个基因,最后通过RT-PCR筛选出在叶里表达的ZmNAC19基因和在雄穗里表达的ZmNAC31基因。通过生物信息学分析ZmNAC19和ZmnAC31基因的启动子序列,这两个基因的启动子区均有NAC转录的顺式作用元件,尤其存在与次生壁增厚的调控元件,说明这两个基因可能参与了植物的次生壁增厚;对ZmNAC19和ZmNAC31蛋白的信号肽和跨膜结构预测,预测出这两个基因均没有信号肽和跨膜结构,推测这两个基因可能是细胞核蛋白,在细胞核中发挥功能。2.利用B73材料对ZmNAC19和ZmNAC31基因进行表达模式分析,RT-PCR和Real-time qRT-PCR结果一致,ZmNAC19基因在叶里面特异性表达,ZmNAC31基因在抽穗前花药第11时期特异性表达。3.本试验利用瞬时表达的方法,对ZmNAC19和ZmNAC31蛋白进行亚细胞定位研究。构建ZmNAC19和ZmNAC31基因的GFP融合表达蛋白,利用共聚焦显微镜观察ZmNAC19和ZmNAC31蛋白的定位,结果表明ZmNAC19和ZmNAC31蛋白定位在细胞核中。4.为了进一步明确ZmNAC19和ZmNAC31基因的生物学功能,构建了ZmNAC19和ZmNAC31基因的过表达载体,通过农杆菌介导法将带有ZmNAC19和ZmNAC31基因的植物表达载体转化至野生型拟南芥,并通过除草剂筛选和DNA分子水平检测,获得转基因T_1代拟南芥种子,对T_2代过表达转基因拟南芥植株进行观察,发现过表达ZmNAC19转基因拟南芥植株较野生型长势旺盛,叶片大于野生型,并且发生叶片卷曲,这与过表达NST1、NST2转基因拟南芥表型相似;过表达ZmNAC31转基因拟南芥与野生型差异不大,由于ZmNAC31基因的表达模式分析出该基因主要在花药里面表达,其次是叶。因此,苗期的ZmNAC31过表达植株的表型不是很明显具有一定的合理性,对于ZmNAC31过表达拟南芥在花药开裂中的作用还需要进一步观察。因此推测,ZmNAC19基因可能参与叶片发育的调控,ZmNAC31基因可能主要参与花药发育的调控,有可能叶片里面的调控对花药里面的调控起着辅助作用。


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