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大豆疫霉PsBTS1的功能分析及敲除突变体对18种化合物的敏感性测定

闫伟棋  
【摘要】:大豆是全球范围内重要的农作物,大豆疫霉病菌引起的大豆疫霉根腐病是一种危害极其严重的土传病害,每年造成严重的经济损失。异戊二烯是生物体中一类功能和结构不同的代谢物,对细胞的生存起着至关重要的作用,甲羟戊酸途径(mevalonate pathway,MVA)被用来合成异戊二烯单元,香叶基香叶基焦磷酸合成酶(GGPPS)是异戊二烯类化合物合成的重要分支酶,它合成的香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)是植物合成叶绿素等所需的重要前体。PsBTS1是编码GGPP合成酶的重要基因。为揭示MVA途径和GGPP在大豆疫霉生长发育中的功能和筛选潜在的药物防控靶标,获得的实验结果如下:1.MVA途径与GGPP合成酶PsBTS1基因生物信息分析大豆疫霉MVA途径中预测到的九种基因与酿酒酵母同源基因具有非常高的相似性,发现MVA途径在疫霉菌中普遍存在并且保守。GGPP基因在进化中的起源很早,可能与细菌、真菌、植物和藻类源于早期的共同祖先,推测其生物学功能和调控的机制在卵菌和真菌中类似,具有保守性。疫霉菌中的GGPP合成酶可能与真菌中的具有类似的催化功能。基因表达图谱结果表明MVA途径在大豆疫霉菌的不同生长发育阶段具有不同的表达图谱,可能具有不同的功能。2.PsBTS1亚细胞定位与酵母功能互补将大豆疫霉中PsBTS1基因融合GFP序列后进行表达,亚细胞定位结果显示,GFP信号位于细胞质中。PsBTS1基因的回补可以弥补酵母BTS1突变体在低温条件下的生长缺陷,证明PsBTS1基因发挥酶功能。3.PsBTS1基因敲除及突变体表型分析使用CRISPR/Cas9技术敲除PsBTS1基因,获得4个基因编辑突变体,对突变体进行表型分析,PsBTS1基因缺失后,突变体生长状态出现明显异常,生长速度减慢,菌落边缘粗糙不规则,形态异常,孢子囊和卵孢子产量下降,致病性降低,证明PsBTS1基因在大豆疫霉生长发育和致病能力中发挥重要功能。4.PsBTS1基因敲除突变体的药剂抑制实验测定18种新型化合物对大豆疫霉野生型(WT)和PsBTS1基因敲除突变体(T4)菌株的抑制效果,发现在50μg/m L浓度下有明显的抑制效果,其中ZS-1、ZS-7、ZS-23、NZ-11、NZ-15和NC-2六种化合物对WT和T4菌株的抑制效果有明显差异,它们对WT菌株的抑制效果明显强于对T4的抑制效果,证明PsBTS1基因缺失突变体对化合物的敏感性降低,推测这六种化合物的作用靶点可能位于PsBTS1基因调控通路上。


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