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布鲁氏菌A19疫苗株核酸标识序列分析及鉴别诊断方法建立的研究

杨博涵  
【摘要】:背景:布鲁氏菌病是一种严重危害人类健康的细菌性人兽共患病。该病菌至今已有90多年的历程,可在世界大范围流行。易感染哺乳及野生动物,可严重侵袭动物的生殖脏器,病理表现为妊娠母畜的流产及关节肿大、跛行、睾丸炎等。临床症状复杂性高,诊断难度较高,防控手段以接种弱毒疫苗为主,我国常用的疫苗为A19、S2等减毒活疫苗,但依然存在疫苗毒性偏高、缺少区别野毒感染与自然感染的缺点。目前,分子生物学检测应用是热门方向,本实验旨在建立A19疫苗株的分子生物学鉴别诊断方法。目的:建立A19疫苗株的分子生物学鉴别诊断方法。以便建立的方法应用于布鲁氏菌病的相关检测和布鲁氏菌A19疫苗株与其他疫苗株、野毒株的区分。方法:1.使用分析软件Mauve对A19疫苗株的全基因序列与2308野毒株序列进行分析比对,找出差异序列后,使用NCBI网站的BLAST功能与其他疫苗株进行分析比对,找到差异序列,其中均存在差异的序列片段即可成为布鲁氏菌A19疫苗株检测方法建立的有效标识序列。2.通过对布鲁氏菌A19疫苗株与其他疫苗株、野毒株的基因序列对比筛选,并根据筛选出的标识序列进行引物和探针的设计合成。用布鲁氏菌A19疫苗株、其他疫苗株及野毒株核酸胶回收产物作为模板,建立A19疫苗株聚合酶链式反应(PCR)检测方法,进行检测方法的退火温度的条件优化,特异性及灵敏度试验,再使用建立的PCR检测方法与布鲁氏菌Bruce Ladder方法对提取DNA的临床样品进行对比验证。3.建立A19疫苗株双重实时定量荧光反应(q PCR)检测方法,进行检测方法的退火温度的条件优化,特异性及灵敏度试验,再使用建立的q PCR检测方法与布鲁氏菌Bruce Ladder方法对提取DNA的临床样品进行对比验证。结果:1.通过Mavue软件对比分析筛选,查找到布鲁氏菌A19疫苗株特有的缺失片段,并根据筛选的差异序列设计合成布鲁氏菌A19疫苗株PCR引物和双重荧光定量PCR引物及探针引物。2.经过对布鲁氏菌A19疫苗株PCR检测方法的退火温度条件优化,确定A19疫苗株PCR检测方法退火温度为66℃,建立的A19疫苗株PCR检测方法特异性良好,只对A19疫苗株产生特异性扩增,PCR检测方法的灵敏度为3×10~2Copies每反应。3.经过对布鲁氏菌A19疫苗株q PCR检测方法的退火温度条件优化,确定A19疫苗株q PCR检测方法退火温度为68℃,建立的A19疫苗株q PCR检测方法特异性良好,只对A19疫苗株产生特异性扩增,q PCR检测方法的灵敏度为30Copies每反应。结论:成功建立了布鲁氏菌A19疫苗株的分子生物学检测方法,可用于布鲁氏菌A19疫苗株的鉴别诊断。意义:建立的检测方法能够用于检测由于布鲁氏菌A19疫苗株干扰影响的布鲁氏菌病的检测,有效区分A19疫苗株与其他疫苗株、野毒株。节省时间、试剂与费用,从而提高布鲁氏菌病检测的准确性与可靠性。有望在提高检测布鲁氏菌病的效率中发挥至关重要的作用,能够及时发现病菌,趁早采取预防治疗措施,从根源处制止疫情迅猛发展,减轻不必要的经济损失和社会安全危害。


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