烟粉虱水平转移基因合成生物素和泛酸的作用研究

【摘要】：烟粉虱(Bemisia tabaci)是一个包括至少36个隐种的复合种,其中隐种MEAM1是世界性重大入侵农业害虫,其含菌细胞内定殖原生共生菌Porteria和次生共生菌Hamiltonella。在长期的进化过程中,烟粉虱共生菌的基因组丢失了很多必需基因。有研究发现,多个细菌源水平转移基因在烟粉虱隐种MEAM1的含菌细胞中高表达,可补充共生菌缺失的基因,然而这些基因的功能尚不清楚。前期研究发现,烟粉虱隐种MEAM1基因组携带细菌源水平转移基因bioA、bioD、bioB和panBC,推测它们可能参与维生素B_7(生物素)和B_5(泛酸)的合成。本论文系统研究了这些基因在烟粉虱体内生物素和泛酸合成中的作用,主要研究结果如下:1.微生物法检测小型昆虫生物素比较营养缺陷型植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum ATCC No.8014)不同继代次数,不同培养方式,不同培养时间拟合的生物素测定曲线,建立了一套小型昆虫生物素含量的测定方法:微氧条件下,使用5代以内菌株,培养19 h以上,测定菌液630 nm的吸光度,可拟合具有良好线性的标准曲线,并依此测定了烟粉虱、温室白粉虱(Trialeurodes vaporariorum)和褐飞虱(Nilaparvata lugens)的生物素含量。该法的生物素加标回收率达94%以上,证明此法能高效精准地测定小型昆虫的生物素含量。2.共生菌影响宿主昆虫B族维生素的合成抗生素处理去除了烟粉虱隐种MEAM1的次生共生菌Hamiltonella和温室白粉虱的次生共生菌Arsenophonus,可显著降低粉虱中维生素B_2、B_3、B_6和B_7的含量,表明这两种次生共生菌能合成维生素B_2、B_3、B_6和B_7。去除烟粉虱隐种MEAM1的原生共生菌Portiera,可显著降低泛酸含量,表明Portiera参与维生素B_5的合成。3.粉虱水平转移基因bioA、bioD、bioB和panBC的进化起源烟粉虱基因组内,基因bioA和bioD有两个拷贝,其中一个为短片段,推测为假基因;基因bioB和panBC均有内含子。多个烟粉虱隐种携带bioA、bioD、bioB和panBC基因,且编码的蛋白序列高度一致。烟粉虱共生菌Hamiltonella和Arsenophonus携带基因bioA、bioD和bioB,蚜虫原生共生菌Buchnera基因组携带panB和panC。但这4个粉虱水平转移基因编码的氨基酸序列与共生菌Hamiltonella、Buchnera和大肠杆菌(Escherichia coli)编码的氨基酸序列相似度较低。系统发育分析显示,烟粉虱水平转移基因bioA、bioD和bioB与床虱和飞虱携带的共生菌Wolbachia以及粉虱寄生蜂恩蚜小蜂携带的共生菌Cardinium具有相同的进化起源。系统发育分析表明烟粉虱水平转移基因panBC来源于Pseudomonas。4.水平转移基因bioA、bioD、bioB和panBC可功能补偿营养缺陷型大肠杆菌大肠杆菌(E.coli)基因(bioA、bioD、bioB、panB和panC)突变后,突变菌株的生长量显著降低,回补烟粉虱相应基因(bioA、bioD、bioB和panBC)的突变菌株在缺乏生物素或泛酸的培养基中生长量恢复。据此,推测烟粉虱基因bioA、bioD、bioB和panBC具有合成生物素和泛酸的功能,且烟粉虱基因panBC兼具panB和panC两个基因的功能。5.水平转移基因bioA、bioD和bioB能为烟粉虱合成生物素,并影响其适合度缺失Hamiltonella的烟粉虱,bioA、bioD和bioB基因表达显著上调。烟粉虱基因bioA、bioD和bioB原核表达产生重组蛋白BioA、BioD和BioB。利用免疫荧光标记烟粉虱的含菌细胞和中肠发现,BioA和BioD主要分布于含菌细胞膜周围的细胞质中,BioB除分布于含菌细胞膜周围,在细胞质其他位置也有分布,三个蛋白与Hamiltonella在含菌细胞内的分布位置不同,在烟粉虱中肠未标记到这三个蛋白。缺失Hamiltonella的烟粉虱含菌细胞内BioA、BioD和BioB免疫荧光信号未发生显著变化,表明BioA、BioD和BioB表达不受共生菌Hamiltonella的影响。烟粉虱的bioA、bioD和bioB基因沉默后,蛋白BioA、BioD和BioB在含菌细胞内的表达水平降低,生物素含量降低,死亡率提高、产卵量下降,但共生菌Hamiltonella的滴度未明显变化,表明Hamiltonella合成的生物素不足以补偿烟粉虱bioA、bioD和bioB基因沉默所降低的生物素。基因bioA沉默后回补生物素,烟粉虱死亡率降低,产卵量增加。这些结果表明水平转移基因bioA、bioD和bioB可以合成生物素,并提高烟粉虱的适合度。6.水平转移基因panBC和Portiera协作合成泛酸,调控烟粉虱和共生菌的适合度烟粉虱基因panBC经过原核表达产生重组蛋白PanBC。利用免疫荧光标记烟粉虱的含菌细胞和中肠发现,PanBC和Portiera都分布于含菌细胞的细胞质内。缺失Portiera的烟粉虱含菌细胞PanBC蛋白表达水平降低。显微注射ds RNA能抑制panBC编码的蛋白PanBC在含菌细胞中表达,降低烟粉虱泛酸含量和Portiera滴度,同时发现烟粉虱死亡率提高、产卵量下降。基因panBC沉默后回补泛酸,烟粉虱的死亡率降低,产卵量增加,Portiera滴度恢复,PanBC表达量也随之恢复。以上结果证明基因panBC能与Portiera协作合成泛酸,并调控烟粉虱和共生菌的适合度。本研究证明了取食植物韧皮部汁液的粉虱携带的共生菌Hamiltonella和Arsenophonus可合成4种B族维生素,并证明了烟粉虱基因bioA、bioD和bioB也能合成生物素,并能提高烟粉虱的适合度;烟粉虱基因panBC与Portiera可协作合成泛酸,泛酸介导烟粉虱和Portiera适合度的共调控。因此,本研究提出了昆虫合成B族维生素的新模式,即昆虫的细菌源水平转移基因可以独自或者与共生菌协作合成B族维生素。本论文证明了真核生物编码的细菌源水平转移基因获得功能需要多拷贝或获得内含子的假说,推测具有功能的水平转移基因将加速共生菌(如Hamiltonella)基因组的退化,并促进烟粉虱-共生菌的互惠共生。以上研究结果不仅深化了我们对昆虫-共生菌协同进化关系及其互作机理的认识,也为烟粉虱的精准防控提供了新的靶标基因。