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草莓果实膜联蛋白基因的cDNA克隆及其遗传转化的研究

杨怀义  
【摘要】:在果实成熟过程中,跃变型果实和非跃变型果实间的生理变化存在着明显差异,其乙烯生成的特性及对外源乙烯的反应方式明显不同。草莓为典型的非跃变型果实,对其成熟的分子生物学基础加以研究,将有助于探明非跃变型果实成熟的机理。现已查明,在草莓成熟过程中存在着一种在果实中特异表达的编码膜联蛋白的mRNA,其所翻译的蛋白可能作为离子通道蛋白、信号肽等在草莓果实成熟过程中起着重要作用,但其cDNA 完整的阅读框架还未获得,在对草莓果实成熟过程中的调控作用还不确切。为此,本研究从草莓果实中分离了其cDNA 的已知片段及5'-端未知序列,构建了反义融合基因,并进行了遗传转化的研究,以期获得该基因表达的缺陷型植株,进而确定其在果实成熟衰老中的调控作用,为非跃变型果实的成熟调控奠定一定的理论基础。 本研究首先针对草莓果实富含多糖、多酚类物质所造成RNA 提取困难的特点,进行了RNA 提取方法的研究,探索出了一种简便、快速、适宜于富含多糖、多酚等化合物植物材料RNA 的提取方法。该方法结合了DNA 核蛋白复合体易溶于水和高盐溶液而难溶于0.14mol/L NaCl 的原理及DNA 趋向分布于酸性酚的特点,有效地去除了DNA 的污染;利用2-BE 能去除多糖、多酚的特点,有效地去除了RNA 中多糖、多酚的污染。采用本方法可在3~4 hr 内得到高纯度、完整的、具有较高逆转录活性的RNA。 以GenBank 中发表的RJ4 cDNA 序列为依据,合成了相应引物,并以从草莓All star 完熟果实中提取的RNA为模板,通过RT-PCR技术获得了836bp的目的片段(含14bp 的酶切接头)。将该目的片段定向克隆于pGEM-3Zf(+)中构建了重组质粒载体pGRJ4,并采用Sanger 双脱氧法以SP6、T7 启动子引物为测序引物对插入片段进行了序列分析,其核苷酸及氨基酸序列与所发表序列的同源性分别达到了99.76%和99.63%。为获得其5'-端未知序列,利用5'-端RACE 技术克隆到了一段180 bp 的cDNA(AnnFaF-5e),其含有蛋白质翻译的起始序列,起始密码子ATG 位于第49 位~第51 位,该片段共编码43个氨基酸。将AnnFaF-5e与RJ4 cDNA片段拼接后得到了AnnFaF cDNA


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