收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

单增李斯特菌及溶血素O与葡萄球菌三种肠毒素免疫胶体金检测技术研究

熊国华  
【摘要】: 单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)简称单增李斯特菌,是一种人畜共患的致病菌,属李斯特菌属,它可引起人和动物患脑膜炎、脑炎、败血症、心内膜炎、流产、死胎及脓肿等,发病者死亡率可达30%~40%。近年来已有不少国家报道了由于污染单增李斯特菌发生的食物中毒事件。因此,世界各国政府部门对单增李斯特菌引起的食物中毒越来越重视,纷纷制定了一些新的食品安全法规,并把单增李斯特菌纳入法定强检项目。而葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxins,SEs)也是重要的人畜共患病原物,能引起人的食物中毒和中毒综合症。这类毒素有很多种,分为SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SEG、SHE、SEI和SEJ,其中SEC又分为SEC_1、SEC_2和SEC_3。 本试验首先根据NCBI检索李斯特菌溶血素O(hly)序列(登录号:[gi:134116121]),设计引物,常规PCR扩增,并将其产物直接与pMD18-T载体连接,构建克隆测序质粒pMD18-T-hly,进行序列分析鉴定。结果表明,PCR合成的hly基因序列与检索到的hly基因序列完全一致。然后用BamHⅠ和XholⅠ分别双酶切pMD18-T-hly载体和表达载体pET-32a(+),并连接获得重组表达质粒pET-32a(+)-hly。经过双酶切和PCR鉴定正确后,转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,构建相应的表达工程菌。利用温度诱导,在30℃诱导培养3.5h后,该工程菌的SDS-PAGE分析显示,有一条相对分子质量约为60kDa的表达蛋白区带,与预期的LLO蛋白的大小相符。经TotalLab20图像软件分析,重组LLO蛋白(rLLO)以包涵体形式存在,表达量约占全菌蛋白的65.48%。 根据重组蛋白C端带有6×His标签的特征,用螯合镍离子.次氨基三乙酸(Ni-NTA)的亲和层析柱对重组蛋白进行一步纯化。在变性条件下LLO经pH梯度洗脱,目的蛋白出现在pH4.5洗脱液中,其纯度达96.21%,经亲和纯化方法可获得约2mg/ml的rLLO蛋白。 将单增李斯特菌和纯化后的rLLO蛋白、葡萄球菌肠毒素免疫新西兰大白兔分别制备抗单增李斯特菌和抗rLLO、SE的多克隆抗体,获得的免疫血清经正辛酸—硫酸铵分步沉淀法和蛋白A亲和层析纯化,其纯度约达98%,定量抗体浓度约为4mg/mL,间接ELISA法检测抗体效价为1:10~8以上,WB结果表明所制备的抗原具有很好的免疫原性。纯化后的抗单增李斯特菌、抗SE和抗rLLO多抗,利用胶体金免疫层析技术,采用双抗体夹心法研制了胶体金检测试纸条,用于检测单增李斯特菌、SE和LLO,并对该方法进行特异性、敏感性、稳定性等评价。该检测方法能在5~10min内完成样品检测,多种不同的菌、蛋白及近缘毒素检测评价显示该法特异性良好,检测灵敏性高,SE在奶粉、血清、牛奶、火腿肠等环境样品的检测敏感性也相同。其中单增李斯特菌的敏感性达到10~6CFU/mL,LLO的敏感性能达到150ng/mL,SEA的敏感性能达到10ng/mL,SEB的敏感性能达到1ng/mL,SEC的敏感性能达到10ng/mL;37℃15天加速试验表明所研制的五种试纸条的稳定性良好,保存期在一年以上。 本研究建立的胶体金检测方法灵敏、准确、特异性强,可进一步应用到检验检疫部门对进出口食品中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的检测实际工作中。此方法建立后,可与经典常规方法互补,预计将在检验检疫、食品工业部门及卫生监控部门具有较广的应用前景,有一定的经济和社会效益。同时,可为食品微生物检验国际方法的修订或增补提供科学依据。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 杨连君,隋延仿,陈志南;葡萄球菌肠毒素抗肿瘤作用研究进展[J];微生物学免疫学进展;1997年03期
2 刘纯杰;葡萄球菌肠毒素检测方法的研究进展[J];肉品卫生;1997年01期
3 胡亚雄,毕重铭;一起由葡萄球菌肠毒素引起食物中毒的调查报告[J];口岸卫生控制;2001年06期
4 袁宝君;用夹心酶联免疫吸附法检测食物中毒食品的葡萄球菌肠毒素A[J];国外医学.卫生学分册;1987年02期
5 P.Hsieh;C.K Zhou;B.L.Wong.;吕刚;;抗葡萄球菌肠毒素A的单克隆抗体[J];细胞与分子免疫学杂志;1986年Z1期
6 唐之华,张维,罗岚,王文风,罗玉芳,吴仲梁,周业农;葡萄球菌肠毒素的纯化及免疫血清的制备[J];复旦学报(医学版);1992年06期
7 李成文,施志国,雷祚荣;4类葡萄球菌肠毒素的3种放大酶联免疫吸附测定技术的研究[J];生物技术通讯;1996年03期
8 吴家驹;;食物中葡萄球菌肠毒素A~E的反向被动血凝简易快速测定[J];国外医学.卫生学分册;1980年02期
9 张维;罗岚;王文风;唐之华;罗玉芳;赵宏年;陆立君;竺蓓;俞翠珠;闻玉梅;吴仲樑;周业农;;用酶联免疫吸附试验检测葡萄球菌肠毒素A、B、C、D的研究[J];上海医学;1992年09期
10 高志贤!300050,晁福寰!300050,姜永强,郑玉玲,王红勇!300050,尚继栋;聚合酶链反应检测葡萄球菌肠毒素B基因[J];中华预防医学杂志;2000年05期
11 刘以贤,刘雪云,杨文平,刘宏道,高庆仪,姚景惠;食品中葡萄球菌肠毒素提取方法的研究[J];卫生研究;1983年03期
12 高志贤,陶桂全,黎高翔;压电免疫传感器检测食品中C_2型葡萄球菌肠毒素(SE)的研究[J];卫生研究;1998年02期
13 莫文梅;;葡萄球菌肠毒素食物中毒2例[J];中国医刊;1989年08期
14 陆贞玉;;食品中金黄色葡萄球菌及检测方法现况[J];预防医学情报杂志;2010年11期
15 Fleischer B ,欧阳笑梅;T细胞抗原受体的探针—细菌毒素[J];国际免疫学杂志;1990年04期
16 蒋亚男;满朝新;赵凤;刘颖;薛玉清;胡惠秩;李博;姜毓君;;环介导恒温扩增方法快速检测乳中单增李斯特菌[J];中国乳品工业;2011年04期
17 杨连君,隋延仿,陈志南;单克隆抗体与葡萄球菌肠毒素A结合物的制备及其抗肝癌作用[J];北华大学学报(自然科学版);2001年03期
18 赵贵明,何艳玲,边凌淳,刘沛;李斯特氏菌选择性培养基改良实验[J];中国公共卫生;2004年08期
19 孙晞,吴建中,张宁,欧仕益,唐书泽;荧光实时定量PCR检测单核李斯特菌方法学建立及应用[J];实用预防医学;2005年03期
20 郑艳影;刘红;潘珍瑜;林萍;;一起蛋糕引起葡萄球菌肠毒素中毒的调查[J];中国卫生检验杂志;2007年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 龙轶;周小明;邢达;;基于磁珠分离和超分支滚环扩增的单增李斯特菌电化学发光检测[A];第七届全国光生物学学术会议论文摘要集[C];2010年
2 范芸;胡云建;艾效曼;宁尚勇;程玮;李江涛;常乃柏;;一起血液病区单增李斯特菌病的爆发并文献复习[A];第十届全国化疗药理暨抗感染药理高峰论坛资料汇编[C];2010年
3 斯国静;俞骅;刘涛;胡俊;;单核细胞增生李斯特菌在市售食品中污染现状分析[A];2011年浙江省医学会医学病毒学分会、医学微生物与免疫学分会学术年会论文汇编[C];2011年
4 马保华;吕平;林日兰;陈锋;劳春霞;;使用Reveal试剂盒快速检测单增李斯特菌的初步研究[A];全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2006年
5 郑华英;江元山;吕均;熊燕;龙一兵;曾莹春;;单增李斯特菌食品分离株多重PCR鉴定分型[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年
6 狄慧玲;姜晓冰;石磊;;速冻食品中单增李斯特菌CRISPR位点分型及PFGE分型研究[A];2010年中国农业工程学会农产品加工及贮藏工程分会学术年会暨华南地区农产品加工产学研研讨会论文摘要集[C];2010年
7 郭倩倩;陶妍;谢晶;;南美白对虾中四种病原菌的多重PCR检测[A];2010年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2011年
8 崔焕忠;张辉;赵权;;单核细胞增生性李斯特菌主要毒力因子及致病机理[A];中国畜牧兽医学会家畜内科学分会2009年学术研讨会论文集[C];2009年
9 陈星;潘迎捷;赵勇;;单增李斯特菌总RNA的提取及2种RNA提取试剂盒的比较[A];2009年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2009年
10 孔保华;刘柳;;香辛料提取物在培养基及冷却猪肉中对单核细胞增生性李斯特菌的抑制作用[A];2007年学术年会论文集[C];2007年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 陈健舜;单核细胞增多性李斯特菌分子进化与酸应激功能基因组学研究[D];浙江大学;2010年
2 隋建新;单增李斯特菌鸡卵黄抗体的抑菌性能及其机理研究[D];中国海洋大学;2010年
3 郗远;植物提取物对单增李斯特菌的抑制作用及乳化香肠的品质影响[D];南京农业大学;2011年
4 田静;熟肉制品中单增李斯特菌的风险评估及风险管理措施的研究[D];中国疾病预防控制中心;2010年
5 张辉;单增李斯特菌ActA的表达、免疫原性及胶体金试纸研制[D];吉林大学;2008年
6 林文凭;Bacillus subtilis ZJU15产生的抗菌肽研究[D];浙江大学;2010年
7 李永明;葡萄球菌肠毒素B(SEB)中和抗体的协同作用及其分子机制[D];第四军医大学;2011年
8 肖性龙;多重荧光PCR与液相芯片高通量病原体检测体系的建立与应用[D];华南理工大学;2010年
9 罗军;IgA分泌细胞在IgA肾病中的分布和迁移研究[D];华中科技大学;2011年
10 陈默;大豆分离蛋白抑菌膜性能评价及抑菌剂释放研究[D];江南大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 熊国华;单增李斯特菌及溶血素O与葡萄球菌三种肠毒素免疫胶体金检测技术研究[D];沈阳农业大学;2007年
2 田媛;抗单增李斯特菌单克隆抗体制备方法的研究[D];河北农业大学;2011年
3 冯晓慧;单增李斯特菌在肉牛屠宰过程中的流行特点及其热失活模型的建立[D];山东农业大学;2011年
4 徐金亭;免疫磁珠的制备及其富集、分离单增李斯特菌的研究[D];暨南大学;2011年
5 林婷婷;单增李斯特菌溶血素基因的原核表达及其单克隆抗体的制备[D];暨南大学;2011年
6 路彦霞;茎环型引物—环介导等温扩增技术检测奶粉中单增李斯特菌的研究[D];河北农业大学;2012年
7 张耀祺;环介导等温扩增法快速检测食物中的单增李斯特菌[D];华南理工大学;2012年
8 陈钢;单增李斯特菌酶联免疫吸附法的研究[D];南昌大学;2010年
9 何勇琴;单核细胞增生性李斯特菌特异性抗体的制备研究[D];上海海洋大学;2011年
10 苗晓莉;单核增生李斯特菌对于宿主抗病毒能力的影响[D];中国科学技术大学;2011年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 王菡娟;我们离“绿色”产品还有多远?[N];人民政协报;2005年
2 阿里;冲破“绿色壁垒”[N];厂长经理日报;2002年
3 连鹏;天然的就是安全的吗[N];中国食品质量报;2004年
4 任宣;美国解除对我蘑菇罐头的“自动扣留”[N];中国国门时报;2004年
5 本报记者 李鹏;蘑菇罐头走出“自动扣留”阴影[N];国际商报;2004年
6 记者 胡冀;43种食品被驱出京城[N];中国食品质量报;2004年
7 王艳 记者 田锦凡;贵州检验检疫局[N];贵州政协报;2010年
8 胡慧平;“苦夏”的饮食调理[N];人民政协报;2001年
9 刘铮;烟台局多措并举确保进口食品安全[N];中国国门时报;2009年
10 中国农业大学食品学院食品非热加工研究室 廖小军;高静压技术之安全篇[N];中国食品报;2009年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978