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草莓和苹果DNA甲基转移酶基因分离及表达分析

常琳琳  
【摘要】: 随着植物微繁殖技术的广泛应用,组织培养导致的表观遗传变异问题引起了人们的重视。DNA甲基化是基因组DNA的一种重要的表观遗传修饰方式,在植物基因组中普遍存在,对植物生长发育及进化起着重要的调节作用。DNA甲基转移酶是DNA甲基化过程中的催化酶。本文首次分离了草莓中具有维持甲基化和重新甲基化功能的MET1类和DRM类DNA甲基转移酶基因全序列,利用实时定量PCR技术研究了两类DNA甲基转移酶基因在草莓微繁殖苗及其后代间的表达差异,同时探讨了病毒对DNA甲基转移酶基因表达的影响;此外,还利用半定量RT-PCR技术对两类基因在‘寒富'苹果二倍体与四倍体中的表达进行了分析。主要结果如下: 1.采用PCR简并引物扩增的方法分别从草莓和苹果中分离出了1条和2条MET1类DNA甲基转移酶基因片段。目的片段长度443bp,包含两个完整的基序(motif)(Ⅳ和Ⅵ)和两个不完整的基序(Ⅱ和Ⅶ)。从草莓和苹果中分别分离出了2条DRM类DNA甲基转移酶基因片段。目的片段长度323bp,包含两个完整的基序(Ⅰ和Ⅲ)和两个不完整的基序(Ⅹ和Ⅳ)。 2.采用染色体步移技术分离出草莓DNA甲基转移酶基因全序列。对于MET1基因,基因全序列的获得经过了1步3′下游步移和3步5′上游步移。得到较长特异片段依次为1634,1812,1308和2786 bp,重叠区域分别为57,76,87和195 bp。4步步移拼接后得到的片段长8171 bp。对于DRM基因,基因全序列的获得经过了1步3′下游步移和4步5′上游步移,得到较长特异片段依次为1405,1835,2354,2142和1847 bp,重叠区域分别为131,75,64,250和372 bp。5步步移拼接后得到的片段长9014 bp。 3.根据染色体步移得到的基因全序列设计分段引物进行分段扩增,并通过5′和3′RACE试验从草莓中分离得到2条MET1类DNA甲基转移酶基因cDNA全长序列,长度5032和5002 bp,分别编码1565和1557个氨基酸,分子量为173.946和173.064 kDa,命名为FaMET1a和FaMET1b。在FaMET1基因序列中预测到8个保守基序和2个BAH结构域。FaMET1a和FaMET1b基因核酸序列和氨基酸序列同源性分别为98.63%和98.72%。遗传进化分析将FaMET1与桃(PpMET1)和毛白杨(PtDMT901,PtDMT901)的MET1划分到同一组。通过5′和3′RACE试验从草莓中还分离获得了3条DRM类DNA甲基转移酶基因cDNA全长序列,长度分别为2273,2282和2288 bp,分子量依次为67.304,67.325和67.304 kDa。3条基因序列均编码596个氨基酸,分别命名为FaDRMa、FaDRMb、FaDRMc。在FaDRM基因序列中预测到7个保守基序和UBA结构域。FaDRM基因核酸序列同源性分别为94.78%(FaDRMa和FaDRMb),97.40%(FaDRMa和FaDRMc),97.17%(FaDRMb和FaDRMc);氨基酸序列同源性分别为100%(FaDRMa和FaDRMc),98.49%(FaDRMa和FaDRMb)。遗传进化分析将FaDRM与烟草(NtDRM1)和番茄(S1DRM5)的DRM划分到同一组。 4.通过基因全序列与cDNA全序列比对发现FaMET1基因有2个内含子,FaDRM基因有10个内含子,符合典型的GT-AG剪接模式。同时发现FaDRM基因中存在选择性剪接现象,包括:3′端选择性剪接和内含子保留两种形式。 5.建立了以总核酸为模板通过RT-PCR同时检测草莓RNA病毒和DNA病毒的简单快速技术体系,成功地检测出‘丰香'与‘全明星'微繁殖苗携带病毒种类。采用基于TaqMan探针的实时定量PCR技术,分析了‘丰香'和‘全明星'脱毒、带毒试管苗和脱毒、与带毒试管苗携带相同种类病毒的微繁殖一代苗中DNA甲基转移酶基因的表达,结果表明组培条件下,病毒会上调两类DNA甲基转移酶基因的表达。脱毒一代苗中两类DNA甲基转移酶基因的相对表达量都高于带毒一代苗中的相对表达量。 6.采用基于TaqMan探针的实时定量PCR技术,分析了‘丰香'微繁殖苗及其后代中两类DNA甲基转移酶基因表达情况。表明两类DNA甲基转移酶基因表达趋势相同,其中在组织培养和移栽阶段表现出低表达,在微繁殖苗后代中得到恢复。 7.利用半定量RT-PCR技术对‘寒富'苹果二倍体植株和秋水仙碱诱导的四倍体植株中两类DNA甲基转移酶基因表达进行分析。结果显示MET1基因在二倍体的幼嫩叶片中表达水平比四倍体植株略高(0.85/0.74),而成熟叶片中表达水平差别很小。无论二倍体植株还是四倍体植株,MET1基因在幼嫩叶片中的表达水平都显著高于成熟叶片中的表达水平。DRM基因表达水平在四倍体与二倍体植株之间没有差异,而且幼嫩叶片和成熟叶片中的表达水平也基本一致。 8.克隆得到FaMET1基因上游669 bp的调控区域和FaDRM基因上游901 bp的调控区域,用草莓DNA甲基转移酶基因启动子替换pCAMBIAl301上GUS基因的CaMV358启动子,分别构建了植物表达载体FMpro∷GUS和FDpro∷GUS。通过农杆菌注射法转化草莓果实细胞,GUS基因的瞬时表达结果表明克隆得到的草莓DNA甲基转移酶基因启动子片段具有启动子活性。


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