紫甘薯多酚氧化酶和β-淀粉酶酶学特性的研究

【摘要】： 紫甘薯是我国近年引进开发出来的一种用于工业加工的甘薯新品种。随着研究的深入,紫色甘薯的开发利用将越来越广泛。 本课题对紫甘薯酶系中对紫甘薯产品的品质和效益影响较大的多酚氧化酶(PPO)和β-淀粉酶进行基础研究,旨在为紫甘薯的精深加工、综合利用及工业化生产提供理论依据;同时增加薯农的收入,增强其在国际市场上的竞争力。 本文采用现代分离技术和先进分析测试手段分离提取、测定了紫甘薯中PPO和β-淀粉酶,并对其酶学特性进行了研究;对PPO反应动力学进行了初步探讨。主要研究结果如下: 用磷酸缓冲液提取紫甘薯中的PPO,以儿茶酚为其褐变底物,采用分光光度法研究了紫甘薯PPO的酶促反应进程。结果表明,PPO作用产物的最大吸收波长为370nm。PPO酶促反应的反应速度在0～3min内呈现很好的线性关系;其后反应速度变慢,12min后反应趋于稳定。 紫甘薯皮部组织中PPO活性高于整块和心部,是心部PPO活性的1.17倍,整块的1.14倍;皮部的褐变强度(BD)也大于整块和心部,为心部褐变强度的1.99倍,整块1.55倍。紫甘薯组织中褐变强度与PPO活性呈显著正相关,经计算相关系数r=0.9895。这说明紫甘薯褐变主要是由PPO引起的酶促褐变。皮部的褐变强度大于心部的褐变强度,是由于皮部组织中所含的PPO的活性比心部的强。 酶学特性研究表明紫甘薯PPO对pH的变化十分敏感,强酸强碱条件均不利于该酶的催化反应。紫甘薯PPO在酸性条件下有较高的活性,在pH4.1和pH6.0出现两个活力峰。其中pH4.1处PPO活力最大,pH6.0处为一肩峰,出现双峰现象可能是由于PPO同工酶所致。pH值小于3.0或大于7.5时,酶活力迅速降低。 紫甘薯PPO最适反应温度为16℃,且酶液在该温度下较为稳定;30℃处有一肩峰,稳定性相对较差。这也再次表明了PPO同工酶存在的可能,这有待更进一步的研究。紫甘薯PPO在10～45℃有较高的活性,且35℃以下酶相对稳定,70℃以上酶稳定性降低。由此可见,此酶对温度较为敏感,且易失活。在处理温度为65、70、75、80、85、90℃时,紫甘薯PPO酶活力半衰期分别为450、240、66、50、21、13s。可见,处理温度越高,PPO的半衰期越短。 鲜切紫甘薯PPO活性在贮藏初期有所上升,第3d达到活性高峰,此后随着贮藏时间的延长而逐渐下降。贮藏结束时PPO酶活力为贮藏前的42.89%。贮藏期间样品的褐变度随时间的延长而增加。前3d的褐变十分迅速,第3d已能观察到明显的褐变现象;结束贮藏的第15d褐变度为4.73,是贮藏前的3.75倍。相关性分析表明,紫甘薯贮藏期间褐变强度与PPO活性呈负相关,相关系数r=-0.8747。可知贮藏期间紫甘薯褐变主要是由PPO引起的酶促褐变。 除了乙二胺四乙酸钠(EDTA-2Na)外,紫甘薯PP0对植酸(PA)、半胱氨酸(L-Cys)、柠檬酸(CA)和维生素C(V_C)这几种供试抑制剂均很敏感,PPO活性均受到不同程度的抑制,且抑制性差异很大。其中抑制效果较好者为V_C,其次是PA和L-Cys,CA对PPO抑制作用稍弱,EDTA-2Na几乎无抑制作用。 根据正交试验筛选所得最佳酶抑制剂组合为0.05%L-Cys+0.03%PA+0.3%V_C+0.3%CA。试验中各因素对鲜切紫甘薯抑制效果主次顺序依次为V_C＞PA＞L-Cys＞CA。其中V_C的护色效果达到显著水平,F值大于F_(0.05)(2.2)。 该复合酶抑制剂安全价廉,对于降低褐变抑制剂的使用成本具有重要意义。四种化学抑制剂的综合应用克服了单一抑制剂的缺点,降低了使用浓度,提高了抑制效果,从而延缓了褐变的发生,且混配时增效作用明显。 紫甘薯PPO是一种多底物的酶,具有相对的专一性。试验分别以苯酚、愈创木酚、儿茶酚、间苯二酚、对苯二酚、L-酪氨酸、绿原酸、焦性没食子酸和间苯三酚9种酚类物质为底物,反应体系在300～400nm范围内均有吸收峰,说明这9种物质都是紫甘薯PPO的作用底物,紫甘薯PPO能催化这9种物质氧化。它们的反应产物的最大吸收波长分别为372、368、370、360、358、374、384、370和362nm。 米氏常数K_m分别为15.68,15.01、12.06、14.71、21.31、17.12、10.23、13.22和13.46 mmol/L。紫甘薯PPO对各酚类底物的亲合性依次为绿原酸＞儿茶酚＞焦性没食子酸＞间苯三酚＞间苯二酚＞愈创木酚＞苯酚＞L-酪氨酸＞对苯二酚。紫甘薯PPO最适作用底物为绿原酸。由这几种酚类底物的分子结构可初步得出结论:紫甘薯PPO对邻羟基结构的作用能力最强,其次是间位羟基,再次为对位羟基;同时取代基及其取代位置的差异也直接影响酶与底物的结合能力。 利用Hanes-Woolf作图法,采用线性回归,求得米氏常数K_m=1.206×10~(-2)mol/L,最大反应速度V_(max)=4.366×10~(-2)mo1/L·min。此结果与根据Lineweaver-Burk法进行双倒数作图计算所得结果V_(max)=4.386×10~(-2)mol/L·min非常接近。根据Arrhenius公式,求得表观活化能E_a=22.93KJ/mol。 各种酶抑制剂对紫甘薯PPO催化反应的抑制作用的强弱是不同的,其中V_C的抑制作用最强,其次是PA、L-Cys,再次是CA。此结论与紫甘薯PPO复合酶抑制剂正交筛选试验的结果相同。 试验表明,V_C对紫甘薯PPO催化儿茶酚反应的抑制属于可逆竞争性抑制,而且试验结果与理论推导相一致。求得与抑制有关的常数K_1=1.34×10~(-2)mol/L,对果蔬的保鲜有重要的指导意义。 本文还研究了缓冲溶液法提取紫甘薯β-淀粉酶的工艺条件并对β-淀粉酶的酶学性质进行了初步的研究。以磷酸缓冲溶液为提取剂,3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法为测定方法,通过单因素试验,确定了影响β-淀粉酶酶活力的主要因素有提取时间、提取液pH值、浸提温度、液料比。通过正交试验进一步优化提取工艺条件,实验结果表明,液料比为5∶1、提取液pH值为6.5、浸提温度为40℃、提取时间为1h,同时以0.5g/L的NaHHSO_3作还原剂,添加9g/L食盐提取效果最佳。 紫甘薯皮层和心层中酶含量的比较实验结果表明,皮层中酶的含量稍高于心层。可考虑利用紫甘薯皮层提取β-淀粉酶,这样既可提高原料综合利用率,又可减少废渣排放,保护环境。 酶的保存稳定性研究表明,β-淀粉酶粗酶液中分别添加0.12%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、0.12%的苯钾酸钠、0.2%的麦芽糖与未添加任何物质的样品相比,添加了0.12%的苯甲酸钠的酶液保存性最好。 紫甘薯β-淀粉酶经DEAE-纤维素-52柱层析、Sephadex G-200柱层析纯化后,层析物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,得到一条谱带,证明紫甘薯β-淀粉酶已得到纯化,分子量约为170 kD。纯化后的酶活提高了18.73倍。 紫甘薯β-淀粉酶的最适反应温度为40℃,70℃后β-淀粉酶失去活力;在40～50℃β-淀粉酶有较好的稳定性。最适反应pH为6.8;pH在5.0～7.0时β-淀粉酶有较好的稳定性。β-淀粉酶的米氏常数为2.25×10~(-5)mol/L,说明紫甘薯β-淀粉酶对淀粉有较强的亲和力,具有较强的水解淀粉的能力。 紫甘薯β-淀粉酶可溶性淀粉水解试验中,水解反应4h时测得水解率最高,超过4h水解率趋于稳定。金属离子Al~(3+)、Zn~(2+)对β-淀粉酶有明显的抑制作用,Cu~(2+)、Fe~(3+)对β-淀粉酶有微弱的抑制作用;Mg~(2+)、Cd~(2+)、Ca~(2+)对β-淀粉酶有微弱的激活作用,在工业化生产中可以选择适当的金属离子作为β-淀粉酶的激活剂。 通过比较烘干法、晒干法、蒸煮法、烘烤法、微波加热法、油炸法六种不同加工方法对紫甘薯淀粉和还原糖含量的影响可知,淀粉含量下降1.02%～9.98%,还原糖含量增加2.60%～31.07%。对于紫甘薯不同加工方法,烘干处理比晒干更易于糖化,蒸煮和烘烤相近,微波加热和油炸相近,但其糖化强度都不及烘晒处理。紫甘薯加工处理后,淀粉和还原糖含量变化的幅度有较大差异,与其所含β-淀粉酶的活性作用的发挥有直接关系。