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刺参2个盐度相关miRNA及互作靶基因的表达分析

王研  
【摘要】:刺参(Apostichopus japonicus)作为重要的棘皮动物,具有很高的经济价值,带来了巨大的效益。而刺参对于养殖水体环境敏感,其中盐度是影响刺参养殖重要的关键因子之一。刺参属于狭盐性生物,只能在适应的盐度环境中维持正常的生理功能,因此较低的盐度制约了刺参养殖产业的发展。Micro RNAs(mi RNAs)是一种长度大约只有22个核苷酸的非编码RNA,其可在转录后通过与靶基因的互补配对从而发挥调控作用。本试验基于课题组构建的18盐度下、6 h的mi RNA文库和c DNA文库测序结果,获得了能够差异表达的micro RNAs和靶基因,从差异表达的micro RNAs和靶基因中选取了两个mi RNA与靶基因,利用双荧光素酶基因报告实验验证其靶向关系后,进行0、6、24、48 h的低盐胁迫后mi RNA与靶基因的表达情况,以及离子浓度与钠钾ATP酶活力的变化,从而探究刺参低盐胁迫后mi RNA与靶基因对于盐度的适应机制以及发挥的作用,获得研究结果如下:(1)基于课题组构建的c DNA文库,从中选取了低盐胁迫下差异表达的SLC9A3基因以及SLC26A6基因。通过RACE(c DNA末端快速扩增技术)实验获得SLC9A3基因全长为1471 bp,开放阅读框1128 bp,共编码375个氨基酸,相对分子质量为42.38734 k Da。总平均亲疏水值为0.746。蛋白结构预测主要元件为α-螺旋、无规卷曲以及β-转角。预测其编码的蛋白质共有8个跨膜螺旋区域,蛋白亚细胞定位分析其主要在内质网以及质膜上发挥作用。SLC9A3基因在刺参体腔液中表达量最高且显著于其他组织,因此其具有组织特异性。通过试验获得SLC26A6基因全长1028 bp,开放阅读框为861 bp,共编码286个氨基酸,相对分子质量为31.88960 k Da。总平均亲疏水值为0.029。蛋白结构预测其主要元件为α-螺旋和无规卷曲。预测其编码的蛋白质有一个跨膜螺旋区域,蛋白亚细胞定位显示其主要在质膜和内质网上发挥作用。(2)通过SLC9A3与mi RNA的序列分析显示mi R-92a与SLC9A3存在互作,其双荧光素酶报告基因结果显示,在野生型中,mimics-mi R-92a与对照组相比极显著减少,而在突变型中则无显著变化,说明mi R-92a与SLC9A3具有靶向关系。荧光定量PCR结果显示mi R-92a经过低盐胁迫后其表达量均低于0 h,而SLC9A3经低盐胁迫后表达量高于0 h,且二者之间存在负向表达模式。在体腔细胞中导入mimics-mi R-92a后,mi R-92a在整个盐度胁迫过程中与对照组相比上调表达,其中24 h表达在整个表达过程中有一个上升的表现。结合盐度胁迫后mi R-92a的表达模式,可能说明刺参盐度胁迫过程中,mi R-92a的低表达是盐度胁迫适应过程中所必需的。在体腔细胞中导入mimics-mi R-92a后,靶基因SLC9A3在整个盐度胁迫过程中与对照组相比上调表达,其中48 h表达量达到最大值。结合盐度胁迫后SLC9A3的表达模式,可能说明刺参盐度胁迫过程中,SLC9A3的上调表达是盐度胁迫适应过程中所必需的。在体腔细胞中导入si-SLC9A3,mi R-92a表达呈先升高至最大值胁迫6 h达到最小值,24 h升高后再降低。SLC9A3表达呈先降低至最小后升高,24h出现下降趋势后48 h达到最大值。转染si-SLC9A3后SLC9A3在随着盐度胁迫时间的延长,其表达量还是出现了上调的情况,结合前面的结果可能进一步说明SLC9A3的高表达是盐度适应过程必需的。向刺参体内注射agomir-mi R-92a后mi R-92a表达呈先升高至最大值胁迫6 h变小,24 h出现升高后再降低至最小值。SLC9A3表达呈先降低至最小后升高,48 h达到最大值。在刺参活体中mi R-92a和靶基因SLC9A3的表达模式与体腔细胞中表达模式相同。在刺参活体中注射si-SLC9A3后mi R-92a表达呈先升高至最大值盐度胁迫6变小,24 h出现升高后再降低至最小值。SLC9A3表达呈先降低至最小后升高,24 h显著低于对照组,48 h达到最大值,与体外试验结果一致。(3)本试验对于转染模拟物低盐胁迫后的刺参体腔液进行了离子浓度、渗透压以及钠钾ATP酶活力的测定。结果显示转染si-SLC9A3后的钠离子浓度低于对照组,钾离子浓度高于对照组,氯离子浓度在先升高在24 h后趋于平稳,转染agomir-mi R-92a钠离子浓度在胁迫6 h降低后升高,钾离子浓度高于对照组,氯离子浓度高于对照组。渗透压在转染以及胁迫后显著降低,24 h升高后降低,刺参转染si-SLC9A3后酶活力显著降低,低盐胁迫后酶活力与对照组相比显著升高,转染agomir-92a组酶活力显著低于对照组。(4)通过SLC26A6与mi RNA的序列分析显示mi R-2013与SLC26A6存在互作,通过双荧光素酶报告基因实验结果显示,在野生型中转染mimics-mi R-2013组表达量显著低于对照组,而突变组无显著变化,因此认定二者之间存在靶向关系。经过荧光定量PCR结果显示,随着低盐时间的延长,mi R-2013的表达升高,而SLC26A6的表达降低,因此二者存在负向调控关系。在体腔细胞中导入mimics-mi R-2013后,在0 h mi R-2013的表达量最高,随着低盐时间延长,其表达量降低,到48 h将至最低;SLC26A6在0 h表达最高,经过低盐胁迫之后表达量降低,在48 h达到最小值。在体腔细胞中导入si-SLC26A6后,mi R-2013在0 h的表达量最高且随着低盐时间延长表达量上升,48 h到达峰值;SLC26A6在0 h表达量低于对照组,随着低盐时间延长表达量降低,48 h到达最下值,二者表达与低盐胁迫下表达模式一致。在刺参体内注射agomir-mi R-2013后。mi R-2013在0 h表达极显著高于对照组,随着时间延长,表达量上升在48 h到达峰值;SLC26A6在0 h表达极显著低于对照组,低盐后,表达量下降。在刺参活体中注射si-SLC26A6后,mi R-2013在0h表达量极显著高于对照组,低盐后,表达量上升48 h达到峰值;SLC26A6在0 h极显著低于对照组,随着低盐时间延长,表达量下降。活体中的表达情况与体外试验以及低盐后的表达模式一致。(5)离子浓度、渗透压以及钠钾ATP酶活力的变化:转染si-SLC26A6后的钠离子浓度低于对照组胁迫后升高,钾离子浓度缓慢降低,氯离子浓度高于对照组缓慢降低。转染agomir-mi R-2013钠离子浓度0、6 h低于对照组,24、48 h高于对照组,钾离子浓度高于对照组,氯离子浓度高于对照组。渗透压在转染以及胁迫后显著降低刺参转染si-SLC26A6后酶活力显著降低,低盐胁迫后酶活力与对照组相比显著升高,转染agomir-2013组酶活力显著低于对照组,胁迫后酶活力降低。


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