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长牡蛎幼虫养殖环境中一株致病性盐单胞菌的分离鉴定

李晨  
【摘要】:牡蛎作为一种经济性贝类,在我国水产养殖中占据重要地位。2020年我国牡蛎养殖产量达542.5万吨,居海水贝类养殖产量首位。随着养殖规模的不断扩大,病害已经成为制约牡蛎养殖业发展的主要障碍之一。2020年春夏季,辽宁省庄河市长牡蛎养殖基地牡蛎幼虫在养殖池塘中爆发“红壳病”。患病幼虫活力减弱,严重者发生组织变红、组织分解和死亡下沉,在显微镜下观察其外壳呈红色。本研究采集发病长牡蛎幼虫养殖池塘池阻沉淀物,将其悬浮于适量池塘海水中制备成悬浊液,用无菌海水稀释后分别涂布于2216E海水培养基平板和TCBS平板(Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium),经多次平板划线纯化获得多株细菌的纯培养,再通过长牡蛎幼虫人工感染试验从中筛选出一株致病性细菌,其能够导致幼虫出现红壳、甚至死亡,编号为7T。抗生素药敏试验结果表明:菌株7T对青霉素不敏感,对诺氟沙星、红霉素、头孢氨苄、四环素、氯霉素及卡那霉素敏感。结合形态观察和基于16S r RNA基因序列的系统发育分析,初步鉴定菌株7T为盐单胞菌属(Halomonas)细菌。本研究分别以牡蛎幼虫、附着稚贝及菲律宾蛤仔幼虫为供试材料,使用浸浴法进行细菌人工感染试验,进一步检测菌株7T的致病性。结果表明:在水体细菌达到一定浓度后,两种不同规格的牡蛎均出现试验处理组的死亡率明显高于对照组的现象,其中较小规格的牡蛎幼虫在经过4天的实验后,在细菌浓度达到10~6、10~7、10~8 cells/m L的实验处理组中,其死亡率均可达90%左右,同时死亡下沉幼虫出现组织变红、分解等,与自然发病症状相似。取人工感染试验患病幼虫研磨,从中分离出的优势菌与菌株7T的形态特征相同。人工感染试验中计算细菌对附着稚贝的半数致死浓度LC_(50)为7.95×10~7cells/m L,提示随着牡蛎幼苗的生长发育,自身抵抗力有所增强,只有当水体中细菌浓度较高时,才会感染发病,这与养殖场牡蛎幼虫养殖池发生病害,而附着稚贝养殖池未发现病害爆发的现象情况相同。综上,可推断分离株7T为导致本次养殖场牡蛎发生病害的病原菌之一。为探讨致病性盐单胞菌菌株7T的防治方法,本研究以7T为供试菌株,检测其对市售的6种生态制剂的敏感性。体外抑菌实验结果表明液态柠檬酸试剂“银弧”、枯草芽孢杆菌“速畅”、液态嗜酸乳杆菌“肠精灵”能够抑制7T的生长。选取这三种试剂以牡蛎附着稚贝为媒介进行人工感染,结果表明“速畅”对菌株7T有抑制作用并且无毒性。本论文从长牡蛎幼虫养殖池塘池阻附近的沉淀物悬浊液中分离获得了一株致病性盐单胞菌属细菌,并对该细菌对海水贝类的致病能力和生物防治等方面进行了初步研究,优选出了防治过程中效果较好的微生态制剂,有望为牡蛎“红壳病”的防治工作提供参考。


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