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Cofilin-1基因在子宫内膜异位症发病机制中的作用研究

许艳丽  
【摘要】:目的 子宫内膜异位症(内异症,Endometriosis, EMs)是育龄期妇女常见病、多发病,具有浸润、转移等恶性肿瘤的特征。迄今为止其发病机制仍未阐明。关于其发病机制,经血逆流学说是目前最被广为接受的理论。但不能解释经血逆流的发生率有80%-90%,而EMs的发生率只有10%-15%。大量研究结果显示,EMs在位内膜基因表达的异常改变可能是内异症发生的基础,这些改变可能直接影响子宫内膜异位症的发病过程。Cofilin-1(CFL1)基因是前期工作中通过cDNA-RDA(cDNA代表性差异分析)技术筛查出的EMs在位内膜与正常子宫内膜差异表达基因,提示其可能与内异症的发生相关,但其在内异症发生中的作用及机制无相关报道。 Cofilin-1基因定位在11q13。CFL1蛋白是一种细胞骨架蛋白,分子量19KD,属于肌动蛋白解聚因子家族。CFL1在促进actin解聚/聚合的转换中占据中枢位置。CFL1通过调节actin细胞骨架的重组参与细胞周期调控、细胞分裂、细胞动力、细胞粘附及肿瘤进展等多种生理及病理过程。癌症细胞中CFL1表达抑制降低了细胞动力。CFL1表达的下调降低侵袭伪足的装配和稳定性,显示了CFL1在细胞侵袭中的重要角色。CFL1与血管发生关系密切,它已经确定为某些血管形成抑制剂的作用靶点。 根据经血逆流学说,粘附、侵袭、血管形成是内异症发病的基本过程。那么与细胞粘附、侵袭、血管形成等均密切相关的CFL1是否参与内异症的发生呢?CFL1在内异症的发生发展过程中具有什么样的作用呢?本研究在国内外首次探讨CFL1在内异症发病机制中的作用。 方法 一、CFL1在子宫内膜异位症在位内膜、异位病灶及正常子宫内膜中的表达 (一)、利用实时荧光定量PCR方法检测CFL1mRNA在子宫内膜异位症在位内膜、异位病灶及正常子宫内膜中的表达。 (二)、利用蛋白免疫印迹技术检测CFL1蛋白在子宫内膜异位症在位内膜、异位病灶及正常子宫内膜中的表达。 二、体外实验研究CFL1对子宫内膜异位症在位内膜间质细胞(ESC)及正常内膜间质细胞(NSC)生物学活性的影响 (一)、原代培养ESC及NSC。 (二)、免疫细胞化学染色鉴定细胞。 (三)、靶向ESC中CFL1基因的RNA干扰:构建3个CFL1shRNA表达载体pRT-CFL-s1、pRT-CFL-s2和pRT-CFL-s3。 (四)、构建pEGFP-N1-CFL重组质粒转染NSC。 (五)、实时荧光定量PCR检测ESC中CFL1基因RNA干扰效果及NSC在转染pEGFP-N1-CFL重组质粒后CFL1mRNA表达水平。 (六)、蛋白免疫印迹检测ESC中CFL1基因RNA干扰效果及NSC在转染pEGFP-N1-CFL重组质粒后CFL1蛋白表达水平。 (七)、CCK-8细胞增殖实验检测CFL表达改变前后细胞增殖的变化。 (八)、应用Annexin V-PE/7-AAD凋亡检测试剂盒检测CFL表达改变前后细胞凋亡的改变。 (九)、细胞粘附实验检测检测CFL表达改变前后细胞粘附能力的改变。 Transwell细胞侵袭实验检测CFL表达改变前后细胞侵袭能力的改变。 (十一)、酶联免疫吸附试验检测CFL表达改变前后ICAM-1、VEGF、MMP-9在细胞培养上清中的含量变化。 (十二)、透射电镜(TEM)观察CFL表达改变前后细胞超微结构的改变。 三、体内实验研究CFL1对ESC及NSC体内种植能力的影响 (一)、原代培养ESC及NSC。 (二)、免疫细胞化学染色鉴定细胞。 (三)、靶向ESC中CFL1基因的RNA干扰。 (四)、构建pEGFP-N1-CFL重组质粒转染NSC。 (五)、腹腔注射细胞悬液构建子宫内膜异位症裸鼠模型,拍摄照片,游离病灶,计算病灶体积 结果 一、CFL1在子宫内膜异位症在位内膜、异位病灶及正常子宫内膜中的表达 (一)、实时荧光定量PCR结果显示以20例正常内膜CFL1 mRNA相对表达水平的平均值为1,CFL1在内异症在位内膜中相对表达水平是正常内膜的(4.56±1.90)倍,CFL1在异位病灶中的相对表达水平是正常内膜的(4.81±1.44)倍,在位内膜及异位病灶分别与正常内膜表达量比较差异有统计学意义(P0.05),在位内膜与异位病灶之间比较差异无统计学意义(P0.05)。 (二)、蛋白免疫印迹显示以正常内膜CFL1蛋白相对表达水平的平均值为1,CFL1蛋白表达水平在内异症组在位内膜的相对表达水平为正常内膜的(3.37±0.30)倍,异位病灶为正常内膜的(3.35±0.35)倍,在位内膜及异位病灶分别与正常内膜表达量比较差异有统计学意义(P0.05),在位内膜与异位病灶之间比较差异无统计学意义(P0.05)。 二、CFL1对子宫内膜异位症在位内膜间质细胞及正常内膜间质细胞生物学活性的影响 (一)、体外成功分离和培养了子宫内膜异位症在位内膜间质细胞(ESC)及正常内膜间质细胞(NSC) (二)、免疫细胞化学染色鉴定结果表明细胞波形蛋白染色阳性,CD10染色阳性,角蛋白、Ⅷ因子及白细胞共同抗原染色均阴性,证实为子宫内膜间质细胞。 (三)、构建了三个靶向CFL1基因的CFL1shRNA表达载体pRT-CFL-s1、pRT-CFL-s2和pRT-CFL-s3及pEGFP-Nl-CFL重组质粒。 (四)、实时荧光定量PCR结果显示:以NSC的CFL1 mRNA相对表达水平的平均值为1,ESC的CFL1mRNA水平为NSC的(4.56±1.90)倍,转染pRT-CFL-s1、pRT-CFL-s2和pRT-CFL-s3三个表达载体后,ESC中CFL1 mRNA水平分别为NSC的(1.88±0.60)、(0.31±0.23)、(0.88±0.39)倍,分别与转染前相比,差异具有统计学意义(P0.05),其中pRT-CFL-s2表达载体对ESC中CFL1mRNA的抑制效果最显著,转染CFL1shRNA阴性对照质粒(pRT-sNC)及空质粒(pRT-V)的ESC中CFL1mRNA表达无明显变化;在转染pEGFP-N1-CFL质粒后CFL1 mRNA相对表达水平为转染前NSC的(3.16±0.99)倍,显著上调(P0.05),转染pEGFP-N1空质粒(pEGFP-N1-V)的NSC的CFL1 mRNA水平无明显变化。 (五)、蛋白免疫印迹结果显示:以的CFL1蛋白相对表达水平的平均值为1,ESC中CFL1蛋白相对表达水平为NSC的(3.37±0.30)倍,转染pRT-CFL-s1、pRT-CFL-s2和pRT-CFL-s3三个表达载体后,ESC中CFL1蛋白水平分别降低为NSC的(1.544±0.36)、(0.33±0.28)、(0.98±0.47)倍,分别与转染前相比,差异具有统计学意义(P0.05),其中pRT-CFL-s2表达载体对ESC中CFL1蛋白的抑制效果最显著,转染pRT-sNC及pRT-V的ESC中CFL1蛋白表达无明显变化;在转染pEGFP-N1-CFL质粒后CFLl蛋白相对表达水平为转染前NSC的(2.444±0.43)倍,差异具有统计学意义(P0.05),转染pEGFP-N1-V的NSC的CFL1蛋白水平无明显变化。与实时荧光定量PCR结果一致。因pRT-CFL-s2对CFL1mRNA和蛋白的干扰效果最强,后续功能试验均选用pRT-CFL-s2。 (六)、CCK-8细胞增殖实验绘制细胞生长曲线显示:从转染pRT-CFL-s2表达载体48h开始,ESC增殖率明显受抑,转染pRT-sNC及pRT-V两个对照质粒后ESC增殖率无明显变化;而NSC在转染pEGFP-N1-CFL质粒48h开始,增殖率显著上调;转染pEGFP-N1-V质粒后NSC增殖率无明显变化。 (七)、Annexin V-PE/7-AAD凋亡检测试剂盒检测结果显示自然状态下,ESC凋亡率显著低于NSC;转染pRT-CFL-s2表达载体后ESC凋亡率显著上升,转染pRT-sNC及pRT-V两个对照质粒的ESC凋亡率无显著变化;NSC在转染pEGFP-N1-CFL质粒凋亡率显著下降,转染pEGFP-N1-V质粒后NSC凋亡率无明显变化。 (八)、细胞粘附实验结果显示自然状态下,ESC粘附力显著高于NSC;转染pRT-CFL-s2表达载体后ESC粘附力显著下降,转染pRT-sNC及pRT-V两个对照质粒的ESC粘附力无显著变化;NSC在转染pEGFP-N1-CFL质粒粘附力显著提高,转染pEGFP-N1-V质粒后NSC粘附力无明显变化。 (九)、细胞侵袭实验结果显示自然状态下,ESC侵袭力显著高于NSC;转染pRT-CFL-s2表达载体后ESC侵袭力显著下降,转染pRT-sNC及pRT-V两个对照质粒的ESC侵袭力无显著变化;NSC在转染pEGFP-Nl-CFL质粒侵袭力显著提高,转染pEGFP-N1-V质粒后NSC侵袭力无明显变化。 (十)、酶联免疫吸附试验结果表明自然状态下,ESC较NSC分泌更多的ICAM-1、VEGF及MMP-9;转染pRT-CFL-s2表达载体后ESC分泌ICAM-1、VEGF及MMP-9较转染前显著减少,转染pRT-sNC及pRT-V两个对照质粒的ESC对三者的分泌量无显著变化;NSC在转染pEGFP-N1-CFL质粒后分泌ICAM-1、VEGF及MMP-9显著增多,转染pEGFP-N1-V质粒后对三者的分泌量无显著变化。 (十一)、透射电镜结果显示在基础状态ESC细胞表面多突起,细胞核形状不规则,多切迹,无染色质边集现象;沉默CFLl表达后,ESC细胞表面突起减少,异染色质呈团块状,多有边集;NSC细胞表面突起较少,异染色质边集现象明显;上调CFL1表达后,NSC细胞表面突起较多,无异染色质边集发生。 三、体内实验研究CFL1对子宫内膜异位症在位内膜间质细胞及正常内膜间质体内种植能力的影响 ESC所构建内异症裸鼠模型的相对异位病灶体积(6.40±1.03)mm3大于NSC的(1.00±0.17)mm3,差异具有统计学意义;转染pRT-CFL-s2表达载体后ESC所构建内异症裸鼠模型的相对异位病灶体积(2.28±2.25)mm3较转染前(6.40±1.03)mm3显著减小,转染pRT-sNC及pRT-V两个对照质粒的ESC所构建内异症裸鼠模型的相对异位病灶体积分别为(5.92±0.45)mm3、(5.81±0.42)mm3,与转染前相比,差异无统计学意义;NSC在转染pEGFP-N1-CFL质粒后构建内异症裸鼠模型的相对异位病灶体积为(3.00±0.54)mm3,较转染前显著增大,转染pEGFP-N1-V质粒后构建内异症裸鼠模型的异位病灶体积(0.73±0.29)mm3,与转染前相比,差异无统计学意义。 结论 1、CFL1基因在子宫内膜异位症在位内膜及异位病灶中表达高于正常内膜。 2、CFL1的过度表达与ESC具有更强的增殖活性,更低的凋亡率,更强的粘附力及侵袭力,能够更多的分泌ICAM-1、VEGF及MMP-9有关,CFL1可能参与内异症的发生发展。CFL1在ESC与NSC之间的差异表达可能是ESC与NSC存在诸多生物学差异的重要因素。 3、ESC比NSC具有更强体内种植能力;CFL1的过度表达与ESC强烈的体内种植能力有关。ESC与NSC之间的CFL1差异表达可能是ESC与NSC体内种植能力差异的重要因素。


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