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狼疮性肾炎易感基因在小鼠模型中的定位及筛选

栗霄立  
【摘要】: 目的 系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus, SLE)是一种多基因相关的自身免疫性疾病,其肾脏损害—狼疮性肾炎(Lupus Nephritis, LN)为经典的免疫复合物性肾病,发病机制复杂,是多个基因与各种环境因素相互作用的累加结果。就个体而言,任何单个基因均不具有决定性意义,不同的遗传背景及环境暴露因素决定了个体的不同临床表型。同时就群体而言,单个易感位点的外显率很低或呈现不完全外显,不同的家系因具有不同的基因组合,而表现出不同的SLE发病过程,即有或没有LN。 从遗传学角度来看,长期的进化和社会文明的发展使人类成为一种高度杂和性物种,具有很高的遗传变异性。同时由于缺乏对易感基因的自然选择过程,使各种易感基因遍布于普通人群中。而且因为伦理的原因人类环境暴露因素、遗传差异无法控制,如果直接进行易感基因定位,要达到理想的灵敏度及特异性,往往需要采集大量家系或几百对同胞对DNA标本。在实际研究中要获得如此庞大的均质病例十分困难。鼠与人类基因具有高度同源性和同线性,小鼠模型中的研究结果可直接用于人类相同或相关基因的研究。 本研究通过建立(NZB×NZW) F1×NZW小鼠模型,以尿蛋白为狼疮性肾炎表现进行全基因组扫描。首先确定NZB (New Zealand Black, NZB)鼠的狼疮肾炎易感基因在染色体上的位置。然后利用基因组计划已取得的成果,绕过繁琐的叠连群-cDNA杂交过程,直接对易感区域内已克隆的基因测序,鉴定出NZB与NZW (New Zealand White, NZW)之间存在差异的基因。最后利用单链构象多态性(Single-Strand Comformation Polymorphism, SSCP)电泳技术分析这些突变基因与狼疮小鼠蛋白尿的相关关系,以探讨LN易感基因在小鼠模型中的意义。 材料与方法 第一部分:选择(NZB×NZW) F1×NZW雌性回交鼠220只,从4月龄开始每2周测定1次尿蛋白,以监测肾脏损伤情况,尿蛋白大于111mg/dl为阳性标准。为便于数量性状位点(QTL)分析,肾脏受累程度依尿蛋白浓度分6级:0级37mg/dl,1级≥37mg/dl,2级≥74mg/dl,3级≥111mg/dl,4级≥333mg/dl,5级≥1000mg/dl,6级≥3000mg/dl。以酚-氯仿法提取鼠尾基因组DNA标本,选定合适的可覆盖小鼠全部19条染色体的微卫星遗传标记进行DNA样本的PCR扩增,根据微卫星DNA片段的长度多态性确定回交鼠的基因型。将全部小鼠的狼疮性肾炎表现型数据和基因型数据录入MAPMAKER/QTL及MAPMANAGER/QTL分析软件包,进行基因组扫描以确定NZB来源的狼疮肾易感基因染色体定位。以LOD值≥3.3为表型与遗传标记间具有显著连锁关系。根据上述连锁分析的结果,将小鼠按不同基因型分组,观察各组间蛋白尿的时间累积发生率,确定不同易感位点的相互关系。组间比较采用χ2检验,P0.05认为有统计学意义。 第二部分:利用ISOGEN试剂盒分别提取NZB、NZW小鼠的脾、肝、肾总RNA, RT-PCR合成鼠cDNA。查询Mouse Genome Informatics (MGI)数据库的表达基因图谱,在易感遗传标记附近确定与免疫功能及调控有关的候选基因41个,针对基因CDS区设计引物69对。热启动PCR分别扩增上述引物的NZB、NZW鼠cDNA,选取合适PCR产物及相应引物进行测序,考虑测序精度,大于600bp的片断全部采用双向测序。结果利用Chromas软件判读,对存在碱基变异处进一步确定有无氨基酸序列变化。 第三部分:(NZB×NZW) F1×NZW回交雌鼠220只,从4月龄开始每2周测定1次尿蛋白,以尿蛋白为指标监测肾脏损伤情况,尿蛋白大于111mg/dl为狼疮肾炎诊断标准。酚-氯仿法提取鼠尾基因组DNA标本,以分光光度计测定OD260值,然后将DNA调至同一浓度8μg/ml,-70℃保存备用。以Bai2编码区mRNA348CAGA缺失为目标,查询GeneBank中的DNA序列,设计SSCP引物F: caggtttgcacacactttgc, R:cgcctcctcctcctcctc,目标片断长度144bp。以Tinagl编码区1713C/T为中心设计引物F:atccacagccacagaagagg, R:agcctggtgcatctttgtct,扩增片断146bp。96孔板在PE9600型PCR仪中扩增全部鼠DNA样本。单链构象多态性(single-strand comformation polymorphism, SSCP)具有温度特异性,随机选取10例PCR产物分别在5℃、10℃、15℃、20℃和25℃条件下进行筛选,确定合适温度后,全部样本进行SSCP电泳,银染后封膜干燥。根据SSCP电泳带确定回交鼠基因型,分别将小鼠按有无蛋白尿和不同等位基因分组,观察各组基因型与蛋白尿的关系,明确Bai2和Tinagl基因在肾损伤中的作用。数据通过x2检验,以P0.05具有统计学差异。 实验结果 第一部分:(1)根据QTL分析,发现两个与狼疮鼠蛋白尿发生有关的易感基因位点,分别位于小鼠第4号染色体60cM附近的D4Mit71区域(LOD5)及第17号染色体18cM附近的D17Mit22区域(LOD7)。(2)根据易感位点基因型的不同,分别将入选小鼠分为纯合子(W/W)及杂合子(B/W)两组进行比较,即D4Mit71 (B/W)与D4Mit71 (W/W)比较,D17Mit22 (B/W)与D17Mit22(W/W)比较,发现无论是D4Mit71还是D17Mit22位点,B/W的尿蛋白累积阳性率均大于W/W型(P0.005)。提示(NZB×NZW) F1×NZW回交鼠的狼疮肾炎易感基因来源于NZB。(3)将全部小鼠按基因型分为4组,即D4BW/D17BW、D4BW/D17WW、D4WW/D17BW、D4WW/D17WW,分别进行两两组间尿蛋白累积阳性率的比较。结果显示D4BW/D17BW小鼠尿蛋白阳性率大于其它三组(P 0.005), D4WW/D17WW尿蛋白阳性率小于其它三组(P0.005),D4BW/D17WW与D4WW/D17BW之间无显著差异(P0.05),但大于D4WW/D17WW组(P0.05)。提示携有两个B/W位点的小鼠尿蛋白阳性率高于只有一个位点的小鼠。 第二部分:由于基因的表达受多种因素影响,具有时空特异性,有些转录本在总RNA中丰度太低无法有效扩增,69对引物可扩出供测序用样本90例。对这些基因片段进行直接测序,比对NZB和NZW的各自序列,逐一确定单核苷酸差异。共发现在狼疮易感区存在变异的基因11个,突变点41个。查询GeneBank数据库,发现14个突变点可导致氨基酸序列的改变,影响了Itlna、Tinagl、Bai2、Traf6、Hist3h2bb、Obscn共6个基因的最终表达产物。 第三部分:(1)根据SSCP条带特点确定(NZB×NZW) F1×NZW回交鼠Bai2及Tinagl基因型,将入选小鼠分为纯合子(W/W)及杂合子(B/W)两组进行比较,即Bai2B/W与Bai2W/W比较,TinaglB/W与TinaglW/W比较。结果发现Bai2B/W和TinaglB/W组的尿蛋白累积阳性率均大于纯和W/W型,经统计学计算有显著差异(P0.001)。(2)小鼠按不同基因型自由组合可分为4组,即Bai2B/W/TinaglB/W、Bai2B/W/TinaglW/W、Bai2W/W/TinaglB/W、Bai2W/W/TinaglW/W。结果发现四组分布极不均匀,Bai2B/W/TinaglW/W、Bai2W/W/TinaglB/W两组个体数量极少,提示两者存在紧密连锁。而Bai2B/W/TinaglB/W小鼠尿蛋白阳性率明显大于Bai2W/W/TinaglW/W组(P0.005)。(3)将全部小鼠按蛋白尿分为2组,进行两组间基因分布频率的比较。结果显示小鼠尿蛋白阳性组Bai2B/W及TinaglB/W基因频率较阴性组明显占优势(P0.005),而Bai2W/W及TinaglW/W在尿蛋白阴性组中分布频率增高(P0.005)。提示两个源于NZB小鼠的基因与动物模型肾脏损伤具有相关性。 结论 1、NZB第4号染色体的D4Mit71区域及第17号染色体的D17Mit22区域为(NZB×NZW) F1×NZW回交鼠的狼疮肾炎易感基因位点。两个位点之间具有协同增效作用。 2、NZB来源的狼疮易感片断中存在11个发生变异的基因,其突变点均发生在基因结构区。其中6个基因即Itlna、Tinagl、Bai2、Traf6、Hist3h2bb、Obscn氨基酸序列改变,因其发生在狼疮易感区,应列为候选狼疮易感基因。 3、携带NZB来源Bai2及Tinagl基因的小鼠尿蛋白阳性率明显增加,提示两者可能为小鼠狼疮肾炎易感基因,应进一步对其编码蛋白、生物学功能进行研究。


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