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RhoGDI2在肺癌中的作用及其调控机制

牛慧彦  
【摘要】: 目的 RhoGDI2是RhoGDIs家族成员之一。RhoGDIs家族是RhoGTPase活化的中心调节分子,各种蛋白,脂类及酶驱动RhoGDIs的替换活动,以调节RhoGTPase/RhoGDI之间亲和力的动态变化。RhoGDI2是Theodorescu等人最先在膀胱癌上确定的肿瘤转移相关的因子,在进一步的研究中他们发现,RhoGDI2在大多数肿瘤起源的细胞系中的表达水平普遍低于相对应正常组织,RhoGDI2在健康和疾病组织中的功能,效应靶点和生理作用仍不清楚。目前研究表明作为肿瘤转移相关的因子,RhoGDI2的表达水平的变化趋势,在不同类型的肿瘤以及同类肿瘤的不同研究层面不尽相同。这些研究结果都表明RhoGDI2可能和肿瘤的发生、发展和转移有关,但是之间的确切关系仍然很不清楚,因此引起了人们极大的关注。 对于肺癌,RhoGDI2作为与肿瘤转移相关的因子,在肺癌细胞系,肺癌组织的具体作用机制,国内外尚无系统研究报道。我们通过免疫组织化学方法.RT-PCR等方法,对RhoGDI2在肺癌组织mRNA和蛋白表达水平的表达进行了的检测;利用RT-PCR、Western Blot和免疫荧光方法,对体外培养的不同类型的肺癌细胞系中RhoGDI2 mRNA和蛋白表达水平的表达进行了的检测;并利用肺癌生长、侵袭转移的经典信号通路PI3K/Akt/mTOR上特异性的激动剂和拮抗剂,通过Western Blot等方法来观察RhoGDI2蛋白水平的变化,以进一步分析RhoGDI2参与肺癌侵袭转移可能的机制。 方法 1、材料 112例肺癌病例的石蜡切片及相应的临床资料由中国医科大学附属盛京医院病理科提供。标本经石蜡包埋、标准条件存放,病例标本包含肿瘤组织及癌旁组织两部分。20例新鲜的肺癌组织及相应癌旁组织取自辽宁省肿瘤医院。术中立即从原发肿瘤及周围正常肺组织中取直径约5-8mm组织块,立即放入液氮中,随后转入-80℃冰箱保存备用。 人肺腺癌细胞系A549和SPC-A-1、人高转移大细胞肺癌细胞系95D及小细胞肺癌细胞系NCI-H446购于中科院上海细胞研究所;Hela细胞系由中国医科大学细胞生物教研室惠赠。 2、免疫组织化学 RhoGDI2一抗(浓度为1:100稀释),阴性对照加PBS缓冲液,4℃冰箱内过夜。结果判断按Shimizu方法,对每张切片阳性细胞的阳性强度按无着色、淡黄色、棕黄色和棕褐色分别打0、1、2、3分,着色阳性面积按无着色、着色1/3、1/3-2/3、2/3分别打0、1、2、3分,然后根据两项打分之和判断其结果,分数3分为阳性。 3、RT-PCR 采用Trizol试剂提取肺癌组织中或培养细胞中的总RNA,利用RNA PCR Kit (AMV)试剂盒进行RT-PCR。RT-PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳。 4、细胞培养和分组 人肺癌细胞系均生长于含10%胎牛血清的RMPI-1640培养基中,内加100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素,置于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养,2-3d传代一次。细胞呈贴壁生长。 rhHGF处理组:lOng/ml组;30 ng/ml组。 LY294002处理组:5μmol/l组;20μmol/l组;50μmol/l组。 Rapamycin处理组:10nmol/l组;20 nmol/1组;40 nmol/1组 联合处理组:LY 5μmol/l+R 10nmol/l组;LY 10μmol/l+R 10nmol/l组 5、免疫荧光 制备细胞爬片,4%多聚甲醛室温下固定20 min,加入RhoGDI2一抗(1:100)湿盒4℃过夜,避光加入FITC标记的山羊抗兔荧光二抗,37℃孵育30 min,使用荧光显微镜观察成像。 6、Western Blot 将含50μg总蛋白的裂解产物进行SDS-PAGE电泳后,转印至PVDF膜,配制一抗稀释液RhoGDI2 (1:200), GAPDH (1:12000),将条带用TTBS略加清洗后分别放入一抗稀释液中,摇床上室温杂交2h,辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1:5000)摇床上室温杂交1h后,ECL法显色。 7、细胞增殖测定实验 采用MTT法,取对数生长期的95D细胞接种于无菌的96孔培养板。实验组分别加入不同的处理因素,继续培养,加入MTT (5g/L) 20μl,放置孵箱内4h后弃上清加入150μl的二甲基亚砜(DMSO),震荡15 min,用全自动酶标仪检测490nm处的各孔吸光光度值(OD值)。以处理因素量为横坐标,相对增殖细胞数为纵坐标绘制细胞增殖曲线。 8、伤口愈合实验 将95D细胞悬液加入6孔板,37℃、5% CO2培养24 h,使细胞贴壁。用10μL枪头在孔中划一直线后,用PBS液再冲洗2次;加入含不同浓度处理因素,以等量无药培养液为对照,37℃、5% CO2继续培养每2小时观察1次,直至划痕被细胞填满。 9、侵袭实验 Matrigel胶用4℃培养液稀释(1:3),在上室中每室加入200μl细胞悬液(4×105个细胞),下室中加入500μl含20%FBS的细胞培养液;37℃、5%C02恒温培养24 h后,用棉签擦去Matrigel胶和上层膜面细胞,无水乙醇固定30min,结晶紫染色5 min,光镜下计数穿膜细胞,每膜计算5个视野,取均值。 10、统计学分析 用SPSS13.0统计包进行统计学分析,当P0.05时认为有统计学意义。 结果 1、RhoGDI2在人肺癌组织中的表达 (1)免疫组化方法显示RhoGDI2蛋白在多数肺癌组织中表达低于相对应的癌旁正常肺组织。肺鳞癌的阳性表达略高于腺癌的表达,但是两者之间差异无统计学意义(P=0.261);高中分化组阳性率高于低分化组,有显著的统计学意义(P0.01); TNM分期Ⅰ-Ⅱ期组阳性率高于Ⅲ-Ⅳ期组阳性率,两者具有显著的统计学意义(P0.01);有淋巴结转移组阳性率低于无淋巴结转移组,两者具有显著的统计学意义(P0.01)。RhoGDI2蛋白阳性表达率与性别和年龄无关(P0.05)。 (2) RT-PCR方法显示RhoGDI2 mRNA在多数肺癌组织中表达也低于相对应的癌旁正常肺组织。 2、RhoGDI2在不同类型肺癌细胞系中的表达 在选取的肺癌细胞系A549、95D、SPC-A-1和NCI-H446中,无论mRNA水平还是蛋白水平RhoGDI2都有表达,但表达水平不尽相同;通过免疫荧光证实RhoGDI2蛋白主要表达在胞浆,细胞核有少量表达。 3、RhoGDI2与PI3K/Akt/mTOR信号通路关系研究 (1)HGF促进95D细胞的增殖,运动迁移和侵袭;而较低浓度P13K抑制剂LY294002和mTOR抑制剂Rapamycin就能抑制95D细胞的增殖,运动迁移和侵袭,联合应用可明显增强这一作用。 (2)无血清培养的95D细胞中RhoGDI2蛋白的表达,高于正常10%胎牛血清培养的细胞组,而10%胎牛血清培养的细胞组与10ng/ml rhHGF组RhoGDI2蛋白的表达水平相当,但30 ng/ml rhHGF组RhoGDI2蛋白表达明显降低。P13K抑制剂LY294002处理组RhoGDI2蛋白的表达量增加,且随浓度增加RhoGDI2蛋白表达也增加。mTOR抑制剂Rapamycin组,在低浓度时增加RhoGDI2蛋白的表达,但增大Rapamycin的浓度,RhoGDI2蛋白的表达反而降低。低浓度LY294002组和Rapamycin组联合应用可以明显增加RhoGDI2蛋白的表达。 结论 1、无论mRNA水平还是蛋白水平,RhoGDI2在肺癌组织中的表达水平均低于相对应的正常肺组织。RhoGDI2的表达与肺癌的组织分化、临床分期和是否淋巴结转移有关,与组织类型,年龄和性别无关。 2、RhoGDI2在肺癌细胞系中仍有低量表达,这表明RhoGDI2下游信号通路可能已被阻断,也更说明RhoGDI2在肺癌细胞系恶性生物学特性中受多种因子及信号通路调节。 3、PI3K/Akt/mTOR信号通路中Akt的活化与RhoGDI2密切相关,RhoGDI2可能直接或间接通过与Akt的相互作用参与调节肺癌的侵袭转移的过程。


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