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2型固有淋巴细胞在RSV气道炎症反应中的作用及其活化机制研究

柴若楠  
【摘要】:目的:哮喘是以气道高反应性和气道炎症为主要特征的、严重危害公众健康的呼吸道疾病。目前全球范围内约有23,500到33,400万哮喘患者,每年约有25万人死于哮喘。在我国,哮喘总患病率约为1.24%,且近年来具有明显上升趋势。包括嗜酸粒细胞、肥大细胞在内的固有免疫细胞,以及适应性免疫细胞如Th2细胞参与哮喘的发生发展。这些免疫细胞及其分泌的细胞因子在诱导哮喘形成和加重呼吸道炎症反应中发挥重要作用。研究发现哮喘患者存在炎症介质及细胞因子的异常表达,例如胸腺基质淋巴细胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin,TSLP)、白细胞介素-33(Interleukin-33,IL-33,)、IL-31、IL-4等均可能通过影响血清IgE水平及肺组织内嗜酸性粒细胞浸润,参与气道炎症和气道高反应性。有文献报道胸腺基质淋巴细胞生成素可以激活树突状细胞和启动Th2型免疫应答,在哮喘炎症阶段尤其是炎症早期发挥作用;白细胞介素-33可以活化和募集巨噬细胞,诱导嗜酸性粒细胞的成熟和生存,并促进肥大细胞分泌高水平IL-13;而总所周知的经典的Th2型细胞因子IL-4是诱导IgE产生的主要细胞因子。近年来研究证实IL-31亦是哮喘的重要参与因子。但迄今为止,包括TSLP、IL-33、IL-31等在内的细胞因子在临床哮喘患者、鼻炎患者、以及哮喘合并鼻炎患者中的表达情况,及其统计比较的相关数据尚不充分。IL-4、IL-31、IL-33、TSLP的表达与哮喘、鼻炎和哮喘合并鼻炎的关联度有多少?过敏性与非过敏性患者血清内IL-4、IL-31、IL-33和TSLP的表达水平是否具有差异?各种过敏因素(尘螨、艾草、霉菌、食物、蟑螂)对这几种因子的产生是否有影响?这些问题值得深入研究和探讨。在诱导哮喘形成和发作的诸多诱因中,病毒感染尤其是呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)感染尤为重要。尽管有研究表明RSV感染可能通过诱导Th2细胞分泌更多的Th2型细胞因子进而诱发或加重哮喘,但常规的哮喘治疗药物对其治疗效果不佳,提示在RSV感染诱发哮喘的发生发展中存在着不同于Th2型细胞的某些致病机制或途径。2型固有淋巴细胞(Group 2 innate lymphoid cells,ILC2s)亦称天然辅助细胞,是新近发现的非T非B的固有淋巴细胞,其主要生物学作用是通过分泌Th2型细胞因子参与过敏性疾病的发生发展。有研究发现,流感病毒感染能导致实验鼠气道反应性显著升高。该升高的气道反应性与适应性应答无关,但却依赖于2型固有淋巴细胞及其产生的细胞因子尤其是IL-13。研究发现卵清蛋白诱导的过敏性哮喘模型中,肺组织局部ILC2s是IL-5和IL-13的重要来源细胞,提示2型固有淋巴细胞在哮喘发生中的关键作用。然而,2型固有淋巴细胞是否参与呼吸道合胞病毒诱导的急性哮喘,其生物学活性及作用机制如何,目前尚不清楚。研究表明IL-33在诱导ILC2s活化过程中发挥关键作用。那么,在RSV感染诱发急性哮喘发生中,ILC2s是否通过IL-33的刺激而活化,进而分泌哮喘相关的细胞因子?目前尚不清楚。本课题以临床患者为研究对象,比对分析哮喘合并或不合并鼻炎患者血清中IL-33、IL-31、IL-4和TSLP等炎性因子血清水平,探讨其与疾病进展程度的相关性,为发现及寻找更多的哮喘辅助诊断指标和治疗效果判定指标提供实验依据。另外通过利用RSV感染诱导的急性哮喘鼠模型,揭示作为IL-33作用靶细胞的2型固有淋巴细胞在RSV哮喘中的生物学作用及其活化机制,为深入了解哮喘免疫学发病机制,阐明固有免疫细胞在哮喘,尤其是病毒感染诱发的非过敏性哮喘中的作用地位,提供实验佐证。研究方法:1、临床患者的筛选:本研究132例患者均为2015年10月至2016年5月期间在沈阳军区总医院过敏科接受治疗的患者。哮喘、鼻炎及哮喘合并鼻炎患者各64例,并依据其血清IgE表达情况将其进一步分为s IgE[+]和s IgE[-]患者。32例健康个体来自沈阳军区总医院健康中心。2、患者外周血的采集:所有患者均在清晨采集静脉血5 mL。3、尘螨或艾蒿过敏实验动物模型:6~8周龄雌性C57BL/6小鼠,在实验的第0、7和14天,腹腔注射尘螨或艾蒿提取物致敏小鼠。从第28天起连续7天用尘螨或艾蒿提取物激发致敏鼠。观察并记录各组哮喘症状。取血清和肺组织进行实验。4、RSV感染诱发的BALB/c鼠急性哮喘模型:用2×10~6 TCID50/鼠的RSV经鼻感染BALB/c鼠。部分小鼠在RSV感染前2 h腹腔注射200μg的anti-IL-33中和抗体以阻断IL-33的作用。5、气道炎症反应:使用1 mL PBS灌洗肺组织,搜集支气管肺泡灌洗液。离心后将细胞沉淀用PBS重悬,计数细胞总数并制备细胞涂片。瑞氏-吉姆萨染色后显微镜下随机选择视野,计数200个细胞,并依据形态学特点分别计数不同类别白细胞数量及其百分比。6、肺单细胞悬液的制备:取肺组织剪碎后,将其加入含有Collagenase D(200μl 10mg/m L)和DNaseⅠ(40μl 10mg/mL)的培养液中,37℃摇床内震荡90 min。消化完成后,使用不锈钢滤网过滤并离心。加红细胞裂解液于细胞沉淀以裂解红细胞。PBS洗涤细胞后用RPMI-1640培养液重悬细胞。7、流式细胞术检测肺组织内ILC2s数量:利用CD16/32抗体封闭细胞表面Fc受体以减少非特异性染色。之后加入不同荧光素标记的lineage cocktail、anti-CD45及anti-ST2单克隆抗体。冰上避光孵育15 min。流式细胞仪分析500,000个细胞,其中表型为CD45~+Lin~-ST2~+的细胞在本研究中被认定为ILC2s细胞。8、肺ILC2s过继回输实验:免疫磁珠分选感染RSV第3天的BALB/c鼠肺ILC2s。RSV感染前2小时,将2×10~4个ILC2s细胞(纯度90%)经尾静脉注入小鼠体内。9、利用ELISA检测试剂盒检测患者血清以及模型鼠肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-10、IL-31、IL-33、IFN-γ以及TSLP水平。10、利用Real-time RT-PCR技术检测患者外周血细胞及模型鼠肺组织内细胞因子IL-4、IL-5、IL-10、IL-31、IL-33、IFN-γ以及TSLP mRNA表达水平。11、利用Western blot方法,检测尘螨或艾蒿致敏鼠肺组织内IL-4、IL-31、IL-33以及TSLP蛋白水平。12、统计分析:所有数据均用PRISM 6.0进行统计分析。组间比较使用χ~2分析或t检验。P0.05为差异具有统计学意义。结果:1、哮喘、鼻炎、哮喘合并鼻炎患者外周血中IL-4、IL-31、IL-33和TSLP表达水平明显升高:利用ELISA及Real-time RT-PCR检测技术发现,哮喘、鼻炎、哮喘合并鼻炎患者外周血中IL-4、IL-31、IL-33和TSLP的表达水平均明显高于正常人。然而,在sIgE[+]和s IgE[-]的患者之间,IL-4、IL-31、IL-33和TSLP表达水平无显著性差异。2、尘螨和艾蒿促进哮喘患者、鼻炎患者IL-4、IL-31,IL-33和TSLP的分泌:通过分析对不同过敏原过敏的哮喘患者、鼻炎患者外周血中IL-4、IL-31,IL-33和TSLP表达水平的差异,证实尘螨和艾蒿可诱导患者产生更高水平的IL-4、IL-31、IL-33和TSLP。3、尘螨和艾蒿可以增加哮喘模型鼠IL-4、IL-31,IL-33和TSLP的表达水平:通过比较尘螨、艾蒿致敏鼠和对照鼠血清和肺组织内IL-4,IL-31,IL-33和TSLP表达水平,证实尘螨和艾蒿是诱导IL-4、IL-33和IL-31,TSLP产生的重要过敏原。4、在RSV感染发生过程中,肺组织内ILC2s是Th2型细胞因子的主要来源细胞:利用实时定量RT-PCR方法,检测肺组织内ILC2s Th1/Th2型细胞因子表达水平的变化。结果表明,RSV感染后肺组织内ILC2s细胞IL-4、IL-5和IL-10的表达水平显著增加,尤其是在感染早期,这种增加更为显著。然而,在病毒感染过程中,并未发现2型固有淋巴细胞IFN-γ表达水平的明显上调,提示在RSV感染过程中,2型固有淋巴细胞可能通过分泌Th2型细胞因子建立优势Th2型应答,进而参与哮喘的形成和发展。5、ILC2s促进RSV介导的气道炎症反应:过继回输实验表明2型固有淋巴细胞可明显加重RSV感染鼠肺组织局部炎症反应,引起炎性细胞肺组织内大量浸润和气道分泌液明显增多。尽管过继回输ILC2s细胞不能明显改变小鼠肺泡灌洗液中炎性细胞总数,但显著增加肺组织内嗜酸细胞数量。此外,回输肺ILC2s细胞可以增加肺组织局部Th2型细胞因子IL-4、IL-5和IL-10的产生,并下调IFN-γ表达,提示2型固有淋巴细胞作为促炎因素,加重病毒感染诱发的气道炎症反应。6、IL-33活化ILC2s细胞:利用单克隆抗体中和模型鼠体内IL-33。结果显示缺少IL-33的刺激,模型鼠肺组织局部ILC2s细胞的绝对数量明显下降,同时其Th2型细胞因子表达水平亦显著降低,提示IL-33可能通过直接或间接作用调控ILC2s活化。结论:1、临床哮喘、鼻炎或哮喘合并鼻炎患者外周血中IL-4、IL-31,IL-33和TSLP水平明显高于健康个体,其中尘螨和艾蒿过敏患者上述细胞因子水平升高更为明显。2、肺组织局部2型固有淋巴细胞通过IL-33活化,进而分泌高水平Th2型细胞因子,参与RSV感染诱发的气道炎症。


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