CXCL9在子痫前期滋养细胞中低表达及可能对其增殖、迁移、侵袭及Akt信号通路作用的影响

【摘要】：前言子痫前期(preeclampsia,PE)是妊娠期特有疾病,是引起孕产妇和胎儿发病和死亡的主要原因之一,其主要临床表现为妊娠20周后出现以高血压和蛋白尿为特征的全身多系统综合征,发病率占孕妇的5%-8%。已有大量的假说和理论阐述子痫前期的病因学,如异常的免疫反应、氧化应激、异常的胎盘植入、胎盘功能以及遗传因素等。国外学者提出了子痫前期发病机制的“两阶段学说”。其中核心内容包括:第一阶段,在孕早期,由于免疫、遗传、内皮细胞紊乱等因素可造成子宫螺旋小动脉生理性“血管重铸”障碍,滋养细胞因缺血导致侵袭力减弱,造成“胎盘浅着床”,子宫动脉血流阻力增加,致使胎盘功能下降;第二阶段,孕中晚期,由于缺血缺氧的胎盘局部氧化应激反应,诱发内皮细胞损伤,从而释放大量炎症因子,形成炎症级联效应和过度炎症的发生,而导致子痫前期及子痫的各种临床症状。尽管国内外学者对其病因及发病机制进行了大量研究,但目前尚无确切的理论学说能满意并全面的解释。因此,对子痫前期发病机制的研究仍是产科医生的一大挑战。趋化因子是一类包含4个保守半胱氨酸残基,具有化学趋化功能的多肽。根据其第1、第2个半胱氨酸之间所含其他氨基酸的个数,可分为CXC、CC、C及C3XC四个家族。趋化因子通过与不同细胞类型的受体结合而发挥不同的功能,在n端区(CXC、CC、CX3C和C)中,趋化因子的作用可分为4个主要基团。趋化因子的主要作用是吸引免疫细胞到免疫应答局部,参与免疫调节和病理反应。趋化因子在机体中发挥重要的生理和病理效应,炎症、肿瘤、自身免疫病等疾病的发生发展均具有趋化因子或其受体的表达异常。已有报道子痫前期孕妇与子代高血压、糖尿病及先天性心脏疾病的发生密切相关,采用超声多普勒测量心脏轴的异常对筛查胎儿心脏具有灵敏度高和特异性强的特点。然而,子痫前期胎儿心脏的异常是否有某些趋化因子表达异常存在相关性目前并不清楚。趋化因子CXCL9又称MIG,人CXCL9基因位于染色体4q21上,属于干扰素γ诱导的CXC家族趋化因子,主要分布在Th1、B细胞和NK细胞等,有介导和调节免疫及炎性反应的作用。正常生理状况下CXCL9在多数非淋巴组织中检测不到,但在发生感染、损伤或免疫炎性反应时可由干扰素γ等诱导而产生。CXCL9的受体是CXC亚族的CXCR3,而CXCR3同时也是趋化因子CXCL10和CXCL11的受体。CXCL9的趋化作用主要通过CXCR3的介导作用完成。我们前期研究,应用DNA微阵列技术检测了正常妊娠孕妇胎盘和子痫前期患者胎盘组织中的基因表达差异,结果显示CXCL9 mRNA在子痫前期患者胎盘滋养细胞中低表达,然而CXCL9在子痫前期患者胎盘滋养细胞中蛋白的定位表达和定量表达是否也存在差异,目前尚不清楚。本研究目的是在前期研究的基础上,探讨CXCL9蛋白在正常妊娠和子痫前期胎盘滋养细胞中定位及定量表达是否存在着差异,并对正常妊娠胎盘滋养细胞增殖、迁移、侵袭及Akt信号通路作用的影响,从而进一步探讨CXCL9在子痫前期发生发展中可能的作用机制。方法第一部分:病例筛选和CXCL9蛋白在子痫前期胎盘滋养细胞中的定位表达差异收集2015年9月-2016年8月在中国医科大学附属第一医院产科分娩的子痫前期患者胎盘30例,同期妊娠健康孕妇患者30例为正常对照组。本研究经中国医科大学附属第一医院伦理委员会批准,所有研究对象均签署知情同意书,孕妇在孕周、年龄、身高、体重等一般条件匹配,月经规则,本次妊娠经过正常,无任何合并症和并发症(子痫前期除外),既往无不良妊娠史,无原发性高血压、糖尿病、肾病、癌症等病史,无嗜烟、嗜酒等不良生活习惯;入组孕妇均为第一次妊娠,单胎,根据末次月经及孕早期超声认真仔细核对孕周。应用免疫组织化学法,检测CXCL9蛋白在子痫前期胎盘中的定位表达;应用Western blot及Real-time PCR法,检测CXCL9在子痫前期胎盘中蛋白和mRNA的定量表达。第二部分:CXCL9对滋养细胞HTR-8/SVneo增殖、迁移及侵袭的影响体外培养滋养细胞HTR-8/SVneo,通过shRNA慢病毒感染敲除CXCL9基因后,应用CCK-8法检测不同干预条件下滋养细胞HTR-8/SVneo的增殖情况;应用transwell法检测敲除CXCL9基因前后滋养细胞HTR-8/SVneo迁移和侵袭能力的改变。第三部分:CXCL9影响滋养细胞HTR-8/SVneo侵袭机制的研究体外培养滋养细胞HTR-8/SVneo,通过shRNA慢病毒感染敲除CXCL9基因后,应用Western blot法,检测敲除CXCL9基因前后滋养细胞中MMP-2及MMP-9蛋白的表达变化;应用特异性Akt抑制剂,检测CXCL9对下游Akt信号通路的作用影响。结果第一部分:我们利用免疫组织化学、Western blot及Real-time PCR方法检测CXCL9在子痫前期胎盘滋养细胞及正常妊娠胎盘滋养细胞中的定位表达变化。结果显示CXCL9在正常妊娠胎盘滋养细胞胞核和胞浆中均呈阳性表达;而在子痫前期患者胎盘滋养细胞胞核和胞浆中的表达减弱及部分滋养细胞表达缺失,两者表达存在着统计学差异,子痫前期胎盘滋养细胞中平均密度明显降低。应用Western Blot和Real-time PCR检测发现CXCL9在子痫前期胎盘组织中的蛋白和mRNA表达水平明显低于正常胎盘组织,其差异具有统计学意义。提示CXCL9蛋白的定位、定量及mRNA的表达可能与胎盘滋养细胞的功能密切相关。第二部分:应用CCK-8细胞增殖检测法,检测CXCL9对滋养细胞HTR-8/SVneo增殖能力的影响,发现被shRNA慢病毒感染后的滋养细胞HTR-8/SVneo的增殖能力明显降低。应用transwell法,检测细胞迁移和侵袭的能力,同时发现被shRNA慢病毒感染后的滋养细胞HTR-8/SVneo迁移和侵袭的能力也明显减弱。第三部分:与阴性对照组比较,CXCL9基因被敲除后的滋养细胞中MMP-2及MMP-9的蛋白表达明显下降,磷酸化Akt(p-Akt)明显下调,而磷酸化ERK(p-ERK)水平没有变化。在未敲除CXCL9基因的滋养细胞中,应用Akt抑制剂MK-2206处理细胞后,MMP-2和MMP-9蛋白水平显著下调。结论1.CXCL9在子痫前期胎盘中蛋白的表达明显低于正常妊娠胎盘中蛋白的表达,说明CXCL9的低表达可能是子痫前期胎盘滋养细胞病变的主要因素。2.CXCL9对滋养细胞HTR-8/SVneo的增殖、迁移和侵袭能力可能具有重要的促进作用。3.CXCL9促进MMP-2和MMP-9的表达上调可能是通过调控Akt通路实现的,而与ERK信号通路可能没有直接关系。