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AKR1B10在肝癌早期诊断中的作用及其抑制剂对HepG2细胞增殖调控的研究

韩超  
【摘要】:目的:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的早期诊断与疾病预后密切相关,因此至关重要。甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)是临床上最常用的、用于HCC早期诊断的血清学指标,但其在HCC早期诊断中的敏感性和特异性仍有不足。因此,临床上亟待新的、敏感的血清标志物用于HCC的早期诊断。目前研究显示AKR1B10与多种肿瘤的发生密切相关,可能是早期诊断肿瘤的血清标志物及抗肿瘤治疗的靶点。1.通过检测HCC患者血清AKR1B10水平,并与慢性肝炎和肝硬化患者进行比较,评价AKR1B10在HCC早期诊断中的价值,并联合AFP建立HCC诊断模型,提高诊断HCC的敏感性和特异性。2.通过检测手术切除肝癌组织中AKR1B10的表达,并比较不同分化程度肝癌组织中AKR1B10表达水平,探讨其与肿瘤发生间的关系。3.通过检测AKR1B10抑制剂依帕司他及shRNA稳定干扰AKR1B10表达对HepG2细胞增殖和凋亡的作用,探讨AKR1B10抑制剂对HepG2细胞增殖的调控作用,并联合HCC分子靶向药物索拉非尼,明确AKR1B10抑制剂能否与索拉非尼产生协同抑制肿瘤细胞生长的作用。研究方法:第一部分:血清AKR1B10在原发性肝癌早期诊断中的研究研究对象为84例原发性肝癌患者、74例肝硬化患者、29例慢性肝炎患者,30例健康者为对照。通过双抗体夹心法ELISA检测所有研究对象的血清AKR1B10水平,并在不同组间进行比较和统计学分析。同时联合AFP建立HCC诊断模型,比较其早期诊断HCC的敏感性和特异性。第二部分:AKR1B10在不同分化程度的肝癌组织中表达水平的研究组织标本为44例肝癌组织切片及37例肝硬化组织切片,其中高分化癌16例,中分化癌19例,低分化癌9例。通过免疫组化的方法检测组织中AKR1B10的表达水平,并在不同组间进行比较和统计学分析。第三部分:AKR1B10抑制剂对HepG2细胞增殖调控的研究用AKR1B10抑制剂依帕司他处理HepG2细胞,并使用慢病毒载体感染HepG2细胞,构建shRNA稳定干扰AKR1B10表达的细胞株,同时联合HCC分子靶向药物索拉非尼,通过检测细胞的增殖及凋亡,评价AKR1B10抑制剂对肿瘤细胞增殖的调控作用,明确其与索拉非尼有无协同抑制肿瘤细胞生长的作用。统计学采用SPSS 17.0软件进行数据的统计学分析,连续变量行标准描述统计,统计量采用均数±标准差进行统计描述,多组比较采用单因素方差分析,其中两两比较采用LSD法进行统计推断,以P0.05为差异有统计学意义。结果:第一部分:血清AKR1B10在原发性肝癌早期诊断中的研究(1)血清AKR1B10水平在HCC、肝硬化、慢性肝炎组中分别为4.02±3.53ng/ml,2.61±2.00ng/ml,1.12±1.01ng/ml,其中以HCC组为最高,且明显高于肝硬化和慢性肝炎组,差异均有统计学意义(P0.05)。(2)在HCC患者中,BCLC早期和中期组患者血清AKR1B10水平(分别为5.94±4.90ng/ml,5.91±3.76ng/ml)明显高于晚期组和终末期组(分别为2.61±1.54ng/ml,2.21±1.60ng/ml),差异有统计学意义(P0.05)。(3)AKR1B10与AFP诊断HCC敏感性与特异性的ROC曲线下面积,分别是0.759、0.796。二者联合诊断HCC的敏感性为92.86%(78/84),特异性为52.63%(70/133),阳性预测值为55.32%(78/141),阴性预测值为92.11%(70/76),显著提高了诊断HCC的敏感性和特异性。第二部分:AKR1B10在不同分化程度的肝癌组织中表达水平的研究(1)与肝硬化组织相比,肝癌组织中AKR1B10表达水平明显升高。(2)在高、中、低分化的肝癌组织中,AKR1B10表达水平不同,以中分化肝癌组织的AKR1B10表达水平最高,高分化肝癌组织次之,低分化肝癌组织表达水平最低,差异有统计学意义(P0.05)。(3)BCLC分期早期组的HCC患者肝癌组织AKR1B10表达水平最高,明显高于中、晚期组,差异有统计学意义(P0.05)。第三部分:AKR1B10抑制剂对HepG2细胞增殖调控的研究(1)依帕司他处理HepG2细胞后,其增殖受到明显抑制,凋亡增加,且呈一定的量效关系。(2)稳定干扰AKR1B10表达的HepG2细胞增殖受到明显抑制,凋亡增加。(3)依帕司他联合索拉非尼处理HepG2细胞,其增殖抑制率及凋亡率显著高于使用单一药物。结论:(1)HCC患者(包括BCLC分期早期患者)的血清中可以检测出AKR1B10,其可作为HCC早期诊断的血清指标。(2)血清AKR1B10联合AFP,可显著提高HCC早期诊断的敏感性和特异性。(3)HCC组织中可以检测出AKR1B10,其表达水平与肿瘤的分化程度有关,在中、高分化HCC组织中高表达。(4)AKR1B10表达水平与BCLC分期有关,其在BCLC分期早期患者HCC组织中表达最高。(5)AKR1B10抑制剂可以明显抑制HepG2细胞的增殖,并促进其凋亡。(6)AKR1B10抑制剂联合索拉非尼可以进一步抑制HepG2细胞的增殖、促进其凋亡,具有协同抑制肿瘤细胞增殖的作用。


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