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非编码RNA miR-137调控tau蛋白磷酸化和L型钙离子通道CACNA1C参与阿尔茨海默病的发生

姜扬  
【摘要】:目的:阿尔茨海默病(AD)是一种神经退行性疾病,其特征在于记忆丧失,多种认知障碍和智力障碍。目前,共有540万美国人患有AD,到2050年这个数字估计会增加到1600万。在全球范围内,到2050年,AD将影响3500多万人。该病在全球范围内造成重大的社会和经济负担。有大量的研究致力于确定AD的发病过程,但是AD发病机制尚未完全清楚。迄今为止,对AD的研究表明,AD开始于大脑的学习和记忆区域,然后扩散到海马,颞叶皮层,额叶皮层和皮质下核。之前的研究表明AD与多种细胞改变有关,包括突触丧失,线粒体功能障碍,神经元丢失,氧化损伤,淀粉样蛋白(Aβ)形成和积累,磷酸化tau(p-tau)形成和积聚以及炎症反应。然而,尚未发现AD明确的早期可检测的生物标志物,并且没有药物可以确切的延迟或阻止AD的进展。大量AD相关研究表明microRNA(miRNA)参与上述的细胞改变。miRNA是短链单链非编码RNA,在转录后调控基因表达中发挥重要作用。miRNA在心血管疾病,肾脏疾病,肿瘤以及神经退行性疾病如精神分裂症,帕金森病和AD等多种人类疾病中起着关键作用。以前的研究表明,miRNAs在神经发生,神经元成熟和大脑发育中发挥重要作用。在这些miRNA中,已经确认在AD患者中调节AD关键基因的几种miRNA,例如:microRNA(miR)-101下调海马神经元中的淀粉样前体蛋白(APP)和纤维状Aβ的表达,miR-219和miR-34下调tau蛋白的表达,miR-26b上调成视网膜细胞瘤1(Rb1,细胞周期和凋亡通路的关键成分)的表达,miR-30a-5p和miR-206下调脑源性神经营养因子基因(BDNF)的表达。这些结果表明,miRNA信号传导功能障碍导致神经退行性疾病和精神疾病。但对AD起关键作用的miRNA尚未完全研究清楚,应进一步研究。人miR-137(hsa-miR-137)是精神病学领域研究热点的miRNA之一。MiR-137是一种大脑富含的miRNA,已被确定与神经退行性疾病相关,如精神分裂症和AD。针对精神分裂症(SCZ)的最大规模的全基因组关联研究(GWAS)将rs1625579确定为与SCZ最强的新关联因素,其位于miR-137的初级转录物的内含子中。关联分析表明,miR-137及其靶基因CACNA1C(L型电压门控钙通道基因的α-1C亚基)与SCZ和双相情感障碍(BP)紧密相关。有关miR-137在AD发病机制中的作用的研究很少,只有Geekiyanage等的报道。因此,在这项研究中,我们研究了miR-137在APP/PS1转基因小鼠和人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞中如何调控AD。在体研究AD小鼠海马和大脑皮层中miR-137及其靶基因CACNA1C的表达水平,同时评估AD小鼠血清,海马和大脑皮质中Aβ1-40和Aβ1-42的表达水平。在体外研究中,研究miR-137对野生型(WT)或突变型(Mut)CACNA1C活性的调节作用,以及CACNA1C和p-tau(Ser202,Ser396和Ser404位点)的表达水平。本研究将阐明miR-137如何调控AD的发生发展,并为AD提供新的治疗靶点。方法:1、动物和抗体:C57BL/6小鼠和B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J小鼠(AD)购自南京大学南京生物医学研究所(南京)。CACNA1C的一抗(1:200;Santa cruz,Santa Cruz,CA,SA),p-tau(Ser202)antibody(1:400;Boster,武汉,中国),p-tau(Ser 396)antibody(1:5000;Abcam,MA,USA),p-tau(Ser404)antibody(1:500;Sangon,Shanghai,China)和Aβ(1:100;Sigma,St.Louis,USA)用于本研究。在本研究中,动物按照动物护理和使用委员会要求进行管理,研究方案经伦理委员会批准。2、Morris水迷宫(MWM):采用安徽正华生物仪器设备有限公司生产的直径120 cm,高40 cm,水深24 cm的MWM进行小鼠空间学习记忆能力的检测。将MWM装置分成四个象限,并在第三象限中放置一个平台(直径9厘米,高23厘米)。MWM测试由两部分组成:第1天至第5天的定位航行试验和第6天的空间探测试验。在定位航行试验中,每天有四条连续的路线进行。每只小鼠在平台上被允许20秒的适应期,然后分别放置在每个象限中,并且在60秒内到达平台。在60s内到达平台的小鼠在平台上停留5s,如果小鼠在60s内不能到达平台并在平台上停留10s,则将小鼠手动引导至平台。在空间探测试验期间,平台被移除并且将小鼠放置在第一象限中,记录小鼠的逃避潜伏期,游泳路径和目标区域频率。3、总RNA提取,cDNA合成和实时定量PCR(RT-PCR):根据生产商的说明书(BioTeke,Beijing,China),使用总RNA快速分离试剂盒分离总RNA。使用Super M-MLV逆转录酶根据生产商的说明书(BioTeke)合成cDNA。设计两对引物(miR-137-F/R和U6-F/R)用于表达分析。使用SYBR GREEN主混合物(Solarbio,Beijing,China)在Exicycler 96(Bioneer,Daejeon,Korea)上进行实时PCR。数据使用2-ΔΔCT方法分析。4、Western印迹:收集组织和细胞样品,并用含有1%苯甲基磺酰氟(PMSF,Beyotime)的RIPA缓冲液(Beyotime,Beijing,China)裂解。使用BCA蛋白质测定试剂盒(Beyotime)测量蛋白质浓度。等量的蛋白质样品在10%SDS-PAGE上分离并转移到PVDF膜(Millipore,Bedford,MA,USA)上。用5%脱脂奶粉封闭膜并用一抗和HRP标记的山羊抗兔IgG(H+L)二抗(1:5000;Beyotime)温育。用ECL Reagent(7sea biotech,Shanghai,China)进行蛋白质显像,并用凝胶成像系统(Liuyi,Beijing,China)成像。β-肌动蛋白被用作内部对照。5、酶联免疫吸附试验(ELISA):Aβ1-40和Aβ1-42的水平使用ELISA试剂盒(针对Aβ1-40和Aβ1-42)(USCN,武汉,中国)按照生产商的说明书进行ELISA测定。使用酶标仪(BioTek,Winooski,VT,USA)读取450nm处的数值。6、免疫荧光(IF)测定:将石蜡包埋的5-μm大脑皮质切片和海马切片用二甲苯脱蜡并用乙醇再水化。之后,切片进行微波抗原修复10分钟,用山羊血清(Zsgb-bio,Beijing,China)封闭。将切片与CACNA1C和Aβ的一级抗体在4℃共孵育过夜,然后与FITC标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)和Cy3标记的山羊抗兔IgG(H+L)二抗孵育。细胞核用DAPI(Beyotime)染色。7、细胞培养,质粒构建和转染:将SH-SY5Y细胞放在含有10%胎牛血清(Hyclone Co.,Logan,USA)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM;Gibco,MA,USA)的5%的二氧化碳环境中。将野生型CACNA1C和突变型的CACNA1C 3'-UTR插入载体pmirGLO(Promega,WI,USA)中。用mi R-137模拟物或miR-137抑制剂转染细胞(4×10~5),以及相应的NC miRNA用于后续实验。转染48小时后,将部分转染的细胞用Aβ1-42(5μM;GL Biochem,中国上海)处理24小时。然后收集细胞用于后续实验。8、荧光素酶测定:使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA),pmirGLO-CACNA1C或pmirGLO-mut-CACNA1C3'-UTR萤光素酶报道质粒和miR-137模拟物或NC miRNA共转染SH-SY5Y细胞(1×10~5,美国)。萤光素酶测定用Dual-uciferase~?Reporter根据生产商的说明书(Promega)进行测定。9、统计分析:统计分析使用Graphpad 6.0进行。两组之间的差异使用Student's t-检验来确定。所有实验重复至少3次,数据以标准差呈现。P0.05有显著性。结果:1、行为测试:使用MWM来评估对照组和APP/PS1小鼠的空间学习和记忆能力。来自定位航行试验的结果显示第4、5天APP/PS1小鼠与对照组之间的逃避潜伏期相比明显延长。空间探测试验结果显示,APP/PS1小鼠目标象限穿越平台的次数和时间百分比明显低于对照组。实验结果表明APP/PS1小鼠的空间学习和记忆能力显著下降。2、APP/PS1小鼠中miR-137,Aβ1-40和Aβ1-42的表达水平:RT-PCR结果显示,与对照组相比,APP/PS1小鼠的海马和大脑皮质中miR-137的表达水平显著降低。APP/PS1小鼠血清,海马和大脑皮层中Aβ1-40和Aβ1-42的水平明显升高。双重免疫荧光染色显示APP/PS1小鼠在海马和大脑皮质中CACNA1C和Aβ表达水平更高。3、miR-137对SH-SY5Y细胞CACNA1C活性和表达的影响:在SH-SY5Y细胞中,miR-137抑制WT-CACNA1C的活性,但不调节mut-CACNA1C的活性。miRNA-137模拟物降低CACNA1C的蛋白表达水平,而miR-137抑制剂增加SH-SY5Y细胞中的CACNA1C的蛋白表达水平。4、miR-137对Aβ1-42诱导的p-tau(Ser 202),p-tau(Ser 396),p-tau(Ser 404)和tau的作用,本研究进一步检测miR-137模拟物和miR-137抑制剂是否调节磷酸化和非磷酸化tau的表达水平。结果显示,Aβ1-42明显上调SH-SY5Y细胞中p-tau(Ser 202),p-tau(Ser 396)和p-tau(Ser 404)的表达水平。MiR-137模拟物明显抑制Aβ1-42诱导的p-tau表达,而miR-137抑制剂明显增加Aβ1-42诱导的p-tau表达。MiR-137模拟物和miR-137抑制剂对非磷酸化tau的表达水平没有明显影响。结论:本研究以阿尔茨海默病(AD)双转基因小鼠模型和人类神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞为研究对象,显示micro-RNA-137(miR-137)在AD小鼠表达水平较低,表明miR-137调节阿尔茨海默病的发病病理过程可能是抑制tau蛋白过度磷酸化实现的。另外,miR-137在SH-SY5Y细胞中与CACNA1C基因的3’-UTR直接结合,从而调节电压门控钙通道亚基alpha-1 C基因(CACNA1C)的表达。本研究的结果发现mi R-137和CACNA1C之间一个新的相互联系,提示miR-137可能是阿尔茨海默病潜在的诊断或者治疗的靶点。


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