黄连素对肠黏膜上皮细胞分泌细胞因子的影响研究

【摘要】：目的:本文利用葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠IBD模型,给予黄连素处理,分离小鼠肠黏膜上皮细胞检测其在调节Th2和Th17功能中可发挥重要作用的细胞因子IL-6、IL-18、IL-23、IL-25和IL-33,同时检测小鼠肠固有层淋巴细胞几种代表性的细胞因子IL-4、IL-10、IL-17A和IFN-γ,以了解黄连素诱导肠黏膜上皮细胞分泌的细胞因子对免疫细胞可能的调节作用,以进一步探究黄连素通过影响肠黏膜上皮细胞细胞因子分泌的种类和水平,间接调节肠道免疫细胞免疫功能,减轻肠道炎症的新机制。研究方法:1、模型建立及实验分组:利用C57BL/6小鼠,建立DSS诱导的急性肠炎动物模型:五天内实验组(黄连素+DSS组)与对照组(DSS组)小鼠均自由饮用3%DSS(用PBS配置)溶液,空白对照组(PBS组)小鼠自由饮用PBS溶液。实验组小鼠每天早八点灌胃黄连素溶液,对照组与空白对照组灌胃等量的PBS溶液,三组小鼠于第六天处死。2、按照Cooper HS的方法,每天定时测量小鼠体重,观察粪便性状、及大便隐血状况。3、组织学结果鉴定:急性肠炎模型诱导第六天,三组小鼠处死后各取近心端1/2处结肠组织0.5cm,浸泡于4%多聚甲醛溶液固定,经脱水、石蜡包埋、切片、HE染色后在光学显微镜下观察模型组织形态结构以及炎症情况,并按照炎症分级标准评估病理组织学得分。4、肠黏膜上皮细胞的鉴定与细胞因子的检测:急性肠炎模型诱导第六天,处死小鼠,三组取肠管后均分离并提取肠黏膜上皮细胞(IEC);用流式细胞仪鉴定IEC并细胞计数后;用Real-time PCR法、Western blotting法检测肠黏膜上皮细胞细胞因子IL-6、IL-18、IL-23、IL-25、IL-33的表达水平。5、肠固有层淋巴细胞的鉴定与细胞因子的检测:急性肠炎模型诱导第六天,处死小鼠,三组取肠管后均分离并提取肠固有层淋巴细胞(LPL);用流式细胞仪鉴定LPL并细胞计数后,在体外刺激48h,用ELISA法检测其IL-4、IL-10、IL-17A、IFN-γ的表达水平。研究结果:1、DSS诱导的小鼠急性肠炎模型建立成功。与PBS组小鼠相比,疾病模型小鼠均出现IBD症状,存在活动减少、体型消瘦、精神萎靡、排泄稀便、血便的现象,疾病活动指数上升,肠管明显缩短、狭窄变形、肠腔内存在稀便。但黄连素+DSS组小鼠较DSS组小鼠相比,疾病症状较轻,肠管病变情况较轻,结果说明经口投黄连素使小鼠急性肠炎症状减轻。2、HE染色结果显示,疾病模型小鼠与PBS组小鼠相比均存在杯状细胞消失、大量炎性细胞浸润的情况。DSS组比黄连素+DSS组情况更加严重,杯状细胞大面积消失、隐窝大面积消失,炎性细胞浸润至黏膜肌层,黏膜增厚并伴有水肿(P0.01)。结果说明经口投黄连素使小鼠肠道炎症程度减轻。3、流式细胞术表面染色实验中,检测到经纯化的肠黏膜上皮细胞层细胞CD3~-B220~-细胞可达95%以上,CD45.2呈单峰,而未经纯化的肠黏膜上皮层细胞CD3~-B220~-仅占43.5%,CD45.2呈双峰。结果说明纯化肠黏膜上皮细胞方法有效。4、流式细胞术胞内染色实验中,分离的肠黏膜上皮细胞经流式胞内染色FITC-CK18,发现峰值明显右移,阳性率达85%以上。结果可证明所提细胞为肠黏膜上皮细胞。5、Real-time PCR法检测结果显示,与DSS组小鼠相比,黄连素+DSS组小鼠肠黏膜上皮细胞内IL-6、IL-23 mRNA表达水平明显下降(P0.01),IL-25、IL-33 mRNA表达水平明显下降(P0.05),IL-18mRNA表达水平明显上升(P0.05)。以上结果说明,在DSS诱导的急性肠炎中,黄连素可以下调肠黏膜上皮细胞因子IL-6、IL-23、IL-25和IL-33 mRNA的表达水平,提升IL-18mRNA的表达水平。6、应用Western blotting法检测结果显示,与DSS组相比,黄连素+DSS组小鼠肠黏膜上皮细胞内IL-6、IL-23和IL-25蛋白表达水平明显降低(P0.05),IL-33蛋白表达水平明显降低(P0.01),IL-18蛋白表达水平明显上升(P0.05),与mRNA检测结果相符。进一步证实黄连素可下调肠黏膜上皮细胞细胞因子IL-6、IL-23、IL-25和IL-33表达水平,提升IL-18表达水平。7、流式细胞术表面染色实验中,检测到所提肠固有层淋巴细胞样本中可圈出大量淋巴细胞(64.1%),其中CD3~+T细胞占46.1%,进一步分群可见51.4%为CD3~+CD4~+T细胞,29.0%为CD3~+CD8~+T细胞,其分群合理。可证实所提细胞为肠固有层淋巴细胞。8、ELISA法检测结果显示,与DSS组小鼠相比,黄连素+DSS组小鼠肠固有层淋巴细胞IL-4表达水平明显下降(P0.01)、IL-17A表达水平明显下降(P0.05),而IFN-γ表达水平明显上升(P0.001)、IL-10表达水平明显上升(P0.05)。结果说明,在DSS诱导的急性肠炎中,应用黄连素使LPL减少了Th2型和Th17细胞分泌的细胞因子,增强了Th1型和Treg细胞分泌的细胞因子,与肠黏膜上皮细胞的此类细胞因子变化水平相类似。结论:1、在炎症状态下,黄连素可抑制肠黏膜上皮细胞细胞因子IL-6、IL-23、IL-25、IL-33的表达水平,提升IL-18的表达水平。2、黄连素可通过影响肠黏膜上皮细胞分泌细胞因子种类和水平,参与肠固有层淋巴细胞应答,发挥免疫调理作用,减轻DSS诱导的小鼠肠黏膜炎症。