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胰岛素抵抗肥胖大鼠中orexin A及其受体1调节胰岛β细胞功能的分子机制研究

索琳娜  
【摘要】:前言:目前随着人们生活方式的改变,肥胖症、糖尿病等代谢性疾病的发病率逐年上升,而这些疾病都有共同的发病基础“胰岛素抵抗”。因此,有关胰岛素抵抗方面的研究一直是内分泌界的研究热点。目前的观点认为:胰岛素抵抗的原因是胰岛素信号转导通路的缺陷。既往关于胰岛素抵抗的研究多集中在肝脏、骨骼肌、脂肪等胰岛素作用的外周组织,而近年来的研究表明,胰岛β细胞除了分泌胰岛素,本身也存在胰岛素信号转导通路,胰岛β细胞本身的胰岛素信号转导通路对维持其数量、生长、分泌功能均起重要作用,而胰岛β细胞本身的胰岛素信号转导通路的缺陷将导致β细胞功能的紊乱,最终参与肥胖症、糖尿病以及其他代谢紊乱性疾病的发生。增食欲素A(orexin A)和增食欲素B(orexin B)是1998年由两组科学团队发现的下丘脑神经肽,通过激活两种G蛋白偶联受体而发挥作用,分别为增食欲素受体1(orexin receptor 1,OX_1R)和增食欲素受体2(orexin receptor 2,OX_2R)。其中OX_1R是首先被发现的,且与orexin A有较高的亲和性。越来越多的研究表明,orexin系统在包括中枢神经系统及多种外周组织中均有表达。大量的资料显示,orexin A及其受体参与多种生理功能的调节,包括摄食、睡眠-觉醒、生长、生殖、应激、能量代谢平衡及内分泌等。最近的研究表明,orexinA及其受体还参与细胞增殖与凋亡的调控。1999年,有学者发现大鼠胰腺组织有orexin A、OX_1R的表达,说明orexin A及其受体OX_1R参与胰岛细胞功能的调节。已有多个实验证实orexin A可在体内、体外影响胰岛素的分泌,但结论并不一致,且机制尚不清楚。另外,关于orexin A及其受体OX_1R对胰岛细胞增殖、凋亡的影响鲜见报道。本研究通过高脂饮食喂养建立胰岛素抵抗肥胖大鼠模型,应用高胰岛素-正常葡萄糖钳夹实验证实模型的建立,观察orexin A及其受体OX_1R,胰岛素受体后信号转导通路IRS-1、IRS-2/PI3K/Akt在胰岛素抵抗肥胖大鼠体内的表达改变,观察orexin A及其受体OX_1R对胰岛β细胞胰岛素分泌、细胞的增殖与凋亡的调节,orexin A及其受体OX_1R对体外培养的INS-1细胞IRS-1、IRS-2/PI3K/Akt等胰岛素受体后信号通路蛋白表达水平的影响,及orexin A及其受体OX_1R对体外培养的胰腺癌细胞增殖的影响,探讨orexin A及其受体OX_1R对胰岛β细胞功能的调节作用及其可能的分子机制。实验方法:1、Orexin A及OX_1R在高脂饮食诱导的胰岛素抵抗肥胖大鼠中的表达研究选择8周龄SPF级雄性Wistar大鼠40只,随机分为2组:正常对照组(NC组)、高脂饮食组(HF组)。NC组予以普通颗粒饲料、HF组予以高脂饲料,饲养8周。8周后,各组大鼠称取体重,每组随机选取5只进行高胰岛素-正常葡萄糖钳夹实验验证胰岛素抵抗大鼠模型的建立。其余大鼠心脏取血,分别进行血糖、血脂、胰岛素、orexin A水平测定。处死大鼠后,摘取肾周及附睾周围脂肪组织称重,留取胰腺组织,应用免疫组化检测胰腺组织OX_1R定位表达,分离提取胰岛细胞,应用实时定量PCR检测胰岛细胞胰岛素受体后信号转导通路(IRS-1、IRS-2/PI3K/AKT)mRNA的表达情况。western-blot技术检测胰岛细胞OX_1R蛋白表达。采用SPSS 13.0统计软件进行分析统计,P0.05表示有统计学意义。2、Orexin A及OX_1R干预胰岛β细胞增殖、凋亡和分泌功能的研究体外培养大鼠INS-1细胞,分别加入不同浓度的orexin A和/或OX_1R特异性抑制剂(SB334867)和/或PI3K特异性拮抗剂(LY 294002)进行干预,western-blot技术检测细胞OX_1R蛋白表达;放免法测定培养液中胰岛素分泌浓度;MTT法检测细胞增殖;凋亡试剂盒检测细胞凋亡。3、Orexin A及OX_1R调节胰岛β细胞内IRS-1、IRS-2/PI3K/Akt信号通路的研究体外培养大鼠INS-1细胞,分别加入10~(-8)M的orexin A和/或SB334867进行干预,western-blot检测IRS-1、IRS-2/PI3K/Akt总蛋白及磷酸化蛋白的表达。4、Orexin A及OX_1R对胰腺癌细胞增殖的影响研究体外培养PANC 1细胞,western-blot检测OX_1R表达,加入orexin A和/或SB408124,CCK-8检测细胞增殖。实验结果:1、Orexin A及OX_1R在高脂饮食诱导的胰岛素抵抗肥胖大鼠中的呈规律性表达(1)胰岛素抵抗肥胖大鼠体重及内脏脂肪变化喂养至8周时,HF组大鼠体重较NC组明显升高,内脏脂肪与体重百分比显著高于NC组。(2)胰岛素抵抗肥胖大鼠血清生化指标的变化HF组大鼠血清TG、TC、LDL-C均显著高于NC组,HDL-C均显著低于NC组,FBG水平有所升高,但是无显著性差异。(3)胰岛素抵抗肥胖大鼠血清胰岛素的变化HF组大鼠FINS较NC组明显升高,但GIR明显降低。(4)胰岛素抵抗肥胖大鼠胰岛细胞胰岛素受体后信号转导通路的变化实时定量PCR结果显示:HF组大鼠胰岛细胞胰岛素信号转导通路IRS-1、IRS-2/PI3K/AKT mRNA表达较NC组明显减少。(5)胰岛素抵抗肥胖大鼠体内orexin A及OX_1R的变化ELISA结果显示:胰岛素抵抗肥胖大鼠体内orexin A水平较NC组明显升高。免疫组化结果显示:大鼠胰腺组织有OX_1R免疫阳性细胞表达,HF组胰腺细胞OX_1R阳性染色颗粒较NC组明显减少。Western-blot结果显示:HF组大鼠胰岛细胞OX_1R蛋白表达较NC组明显减少。2、Orexin A及OX_1R干预胰岛β细胞增殖、凋亡和分泌功能(1)Orexin A对INS-1细胞OX_1R蛋白表达的影响不同浓度的orexin A均可诱导INS-1细胞OX_1R蛋白的表达,其中10~(-10)M和10~(-8)M组效应具统计学意义。(2)Orexin A对INS-1细胞胰岛素分泌水平的影响不同浓度的orexin A均可促进INS-1细胞基础及高糖刺激后的胰岛素分泌,其中10~-88 M浓度时的orexin A刺激胰岛素分泌效应最显著。加入OX_1R特异性抑制剂后,orexin A对INS-1细胞胰岛素分泌的刺激作用受到抑制。加入PI3K特异性拮抗剂后,orexin A促进胰岛素分泌的作用受到部分抑制。(3)Orexin A对INS-1细胞增殖的影响10~(-10)M和10~(-8)M的orexin A均可诱导INS-1细胞增殖,效应有统计学意义,OX_1R特异性抑制剂可抑制这种作用。加入PI3K特异性拮抗剂后,orexin A促进胰岛细胞增殖的作用受到部分抑制。10~(-6)M浓度orexin A组则未观察到显著效果。(4)Orexin A对INS-1细胞凋亡的影响10~(-10)M和10~(-8)M浓度的orexin A可显著减少INS-1细胞凋亡,而10~(-6)M浓度的orexin A不具有这样的作用,同样加入OX_1R特异性抑制剂可抑制这种凋亡保护作用。加入PI3K特异性拮抗剂后,orexin A减少胰岛细胞凋亡的作用亦受到部分抑制。3、Orexin A及其受体1调节胰岛β细胞内IRS-1、IRS-2/PI3K/Akt信号通路的研究(1)培养液中加入10~(-8)M orexin A可使IRS-1、IRS-2/PI3K/Akt磷酸化蛋白表达水平上调,总蛋白表达水平无明显改变。(2)培养液单独加入OX_1R特异性抑制剂SB334867后,INS-1细胞IRS-1、IRS-2/PI3K/Akt磷酸化蛋白表达水平无明显变化,但其可抑制orexin A的作用。4、Orexin A及OX_1R对胰腺癌细胞增殖的影响研究(1)PANC 1细胞中OX_1R表达升高。(2)加入Orexin A后PANC 1细胞增殖增加,但OX_1R特异性抑制剂SB408124可抑制orexin A的作用。结论:1、高脂饮食诱导的肥胖大鼠体内存在胰岛素抵抗病理特性;胰岛细胞胰岛素受体后信号转导通路受损。2、胰岛素抵抗肥胖大鼠体内血浆orexin A水平升高,其受体OX_1R在胰腺组织蛋白表达水平显著降低,说明其可能参与胰岛细胞功能的调节。3、orexin A通过OX_1R及PI3K通路调节胰岛β细胞分泌功能,并促进胰岛β细胞增殖、抑制细胞凋亡。4、orexin A通过OX_1R正性调节INS-1细胞内IRS-1、IRS-2/PI3K/Akt胰岛素受体后信号转导通路,参与干预INS-1细胞分泌功能及细胞增殖和凋亡的调节。5、OX_1R在胰腺癌细胞中高表达,orexin A通过OX_1R调节PANC 1细胞增殖。


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