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蛋氨酸脑啡肽(MENK)通过阿片受体(OGFr)抑制胃癌恶性生物学行为的作用及机制研究

王晓楠  
【摘要】:目的:胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性消化道肿瘤,是世界上最常见的恶性肿瘤之一,在我国各种恶性肿瘤中发病率居首位,在全球癌症患者死亡率中高居第三位。现今,外科手术仍然是胃癌的主要治疗手段,但胃癌的总体治疗模式已经发生了显著的改变,从以解剖学为基础的手术治疗慢慢走向以解剖学、肿瘤生物学及免疫学为基础的联合规范化手术和围手术期辅助治疗的综合治疗模式。蛋氨酸脑啡肽(MENK)是阿片类物质受体的内源性配基,是一种由肾上腺产生的前激素和前脑啡肽衍生而来的内源性阿片样物质物质,其结构为酪-甘-甘-苯丙-蛋氨酸五个氨基酸构成的五肽,无药物依赖性和种属特异性。对MENK的早期研究主要集中在作为镇痛剂和神经递质方面的功能。直至八十年代初Wybran证明神经系统与免疫系统的联系后,其免疫调控方面的研究才有了较快发展。阿片受体在免疫系统细胞中均有表达,包括:树突状细胞、单核细胞(巨噬细胞)、T淋巴细胞、自然杀伤细胞、嗜酸性/嗜碱性粒细胞和中性粒细胞。一些肿瘤细胞如:胰腺癌细胞核膜表面和肠癌细胞表面也存在类阿片受体。研究证明,适宜浓度的MENK结合免疫细胞阿片受体后,可以作为内源性免疫系统调节的信使,在免疫系统和中枢神经系统之间起桥梁作用,并具有显著的免疫调节作用。除此之外,一系列的体内和体外研究发现,MENK除具有免疫调节信使的作用外,还可直接作用于癌细胞阿片受体,起到抑制肿瘤生长。我们课题组前期研究证实MENK可以通过诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期在G0/G1期来抑制人类黑素瘤癌细胞的体外增殖。MENK这种既能直接抑制肿瘤又能通过调控免疫反应抑制肿瘤生长的独特的作用方式,为其成为新型抗癌药物提供了绝对优势。那么,MENK对胃癌是否同样具有抑制作用?是如何直接抑制肿瘤生长的?其具体作用机制如何?研究方法:1、体外,qRT-PCR法检测各胃癌细胞系(AGS、BGC823、SGC7901、HGC27、MGC803、MKN45)中是否表达OGFr以及表达量的多少,选择表达量相对高的细胞系进行后续的实验检测。体外,用不同浓度的MENK(0、0.5、1、2、5、10、12.5 mg/mL)分别作用于人胃癌细胞HGC27和SGC7901 24,48,72,96 h;同时,用相同浓度的MENK作用于人正常胃粘膜上皮细胞GES-1 24,48 h,采用CCK-8试剂盒检测MENK的抑制效果。选出MENK合适的作用时间和作用剂量进行后续的胃癌细胞功能学实验。2、体外,5 mg/mL MENK作用于HGC27和SGC7901细胞48h后,行以下实验检测:与空白对照组比较,光学显微镜观察胃癌细胞的形态改变;克隆形成实验检测胃癌细胞的增殖能力改变;流式细胞术检测胃癌细胞的周期改变和细胞凋亡情况;Hoechst 33258染色法观察细胞凋亡形态;Transwell和细胞划痕实验检测胃癌细胞迁移和侵袭情况。之后,收集空白组和MENK给药组的两种胃癌细胞,提取mRNA和蛋白,qRT-PCR法检测OGFr、Ki67、Bax、BCL-2、MMP-2、MMP-9的mRNA表达改变,Western blot法检测OGFr、Bax、BCL-2的蛋白表达改变。3、体内,构建人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型。裸鼠头颈部皮下接种SGC7901细胞,成瘤后,将裸鼠随机分成两组:MENK给药组(5 mg、8 mg、10 mg/2d)和阴性对照组(NS)。每日观察裸鼠生命体征,动态监测裸鼠体重和皮下瘤体积变化。22天后颈椎脱臼处死裸鼠,剥离皮下肿瘤称重。制备皮下移植瘤石蜡切片,做以下检测:HE检测组织病理,免疫组化检测组织内OGFr和Ki67表达,TUNEL法检测组织凋亡改变。同时,免疫组化检测皮下瘤组织中肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)表面标志F4/80、CD64、CD206和分泌性细胞因子TNF-α、IL-10的表达水平。另外,构建人胃癌裸鼠尾静脉转移模型,将裸鼠随机分成两组:MENK给药组(8 mg/mL,次/2d)和阴性对照组(NS)。治疗2个月后颈椎脱臼处死裸鼠,解剖取肺和肝脏,观察表面肿瘤转移灶个数。4、信号通路研究:进一步将OGFr沉默,观察MENK对胃癌的抑制作用是否减弱或消失,探讨MENK是否通过OGFr抑制胃癌。利用siRNA脂质体瞬转法,qRT-PCR检测沉默效果,筛选出有效序列。将OGFr-siRNA有效序列包成慢病毒,构建OGFr稳定沉默的人胃癌细胞株。之后,将细胞分成三组,包括si-NC组、si-NC+MENK组、si-OGFr+MENK组,常规检测MENK对胃癌细胞克隆形成和凋亡的影响。qRT-PCR检测Bax、BCL-2、Caspase-3、PARP、Ki67、Cyclin D1、c-myc、survivin、MMP-2、MMP-9的mRNA水平;Western Blot检测Bax、BCL-2、Caspase-3、PARP、PI3K、AKT、p-AKT、mTOR蛋白表达水平。结果:1、体外,大多数胃癌细胞系普遍存在OGFr的表达,选取表达相对较高的HGC27和SGC7901细胞开展后续实验。体外,MENK可显著抑制HGC27和SGC7901细胞的增殖,具有浓度依赖性和时间依赖性,并且对人正常胃粘膜上皮细胞GES-1无明显抑制作用。MENK作用后,HGC27和SGC7901细胞形态由多角鹅卵石形变成条梭状,粘附力变低,细胞数量减少,伴有细胞克隆数量减少;阻滞细胞周期在G0/G1期;诱导胃癌细胞发生凋亡;抑制胃癌细胞的迁移和侵袭。MENK可上调HGC27和SGC7901细胞中OGFr的表达。MENK作用后,mRNA水平,Ki67表达下调,Bax上调,BCL-2下调,MMP-9下调,MMP-2改变不显著;同时,MENK上调Bax蛋白表达,下调BCL-2蛋白表达。2、MENK可抑制人胃癌裸鼠皮下移植瘤的生长。MENK治疗后,胃癌皮下瘤体积明显减小,瘤重明显减轻,裸鼠体重无明显变化。病理组织学检测发现,MENK治疗组移植瘤中央区域出现大面积坏死,伴有凋亡,核浓染固缩;相对地,空白组移植瘤中细胞形态整齐,排列紧密,有小量分散的坏死区域。表明MENK可通过诱导移植瘤细胞凋亡来减慢裸鼠SGC7901移植瘤的生长,TUNEL分析法进一步证实这一结论。另外,MENK对尾静脉模型中胃癌肝转移有较为明显的抑制作用;对肺转移的影响还需要增大样本量,进一步重复实验来最终确定。免疫组化检测结果显示,移植瘤胃癌组织中有OGFr的表达,并且MENK可上调OGFr表达水平。MENK下调Ki67的表达水平,这与体外实验结果保持一致。3、体内,MENK通过诱导TAMs由M2向M1极化发挥抑制胃癌作用。在MENK治疗组的移植瘤组织中,TAMs表达CD64的比例显著增加,CD206阳性细胞比例降低。同时,MENK治疗组,M1型相关细胞因子TNF-α的表达增加,M2型相关细胞因子IL-10的表达减少。数据表明,在MENK治疗组肿瘤中TAMs的浸润程度较高,MENK可能通过诱导TAMs由M2向M1表型转化,增强TAMs的抗肿瘤活性,发挥抑制胃癌的作用。4、OGFr沉默后,MENK对人胃癌细胞HGC27和SGC7901增殖的抑制作用明显减弱,MENK诱导人胃癌细胞凋亡的作用被逆转。MENK可降低胃癌细胞中周期相关基因Ki67、cyclin D1、c-myc的mRNA表达水平,OGFr沉默后此作用明显减弱。MENK可下调凋亡相关基因BCL-2的mRNA和蛋白水平,同时可上调Bax和Caspase-3的mRNA和蛋白水平和PARP的蛋白表达。MENK作用显著降低survivin的mRNA水平。另外,MENK可下调PI3K/AKT/mTOR通路中PI3K、p-AKT、mTOR蛋白表达。OGFr沉默后以上作用均明显减弱。结论:1、体内外实验均证实,MENK在合适的作用剂量下具有显著抑制胃癌的作用。2、MENK可通过阻滞细胞周期,诱导细胞凋亡,抑制细胞迁移和侵袭,以及可能通过诱导TAMs由M2向M1表型转化,增强TAMs的抗肿瘤活性,发挥抑制胃癌作用。3、多数人胃癌细胞系中存在阿片受体OGFr的不同表达。MENK可显著上调胃癌细胞中OGFr的表达水平。MENK通过结合OGFr后触发抗肿瘤机制。4、MENK可通过下调cyclin D1、c-myc的mRNA表达来诱导人胃癌细胞细胞周期阻滞在G0/G1期。5、MENK可通过调控BCL-2/Bax/caspase-3/PARP信号通路诱导凋亡发生,发挥抑制胃癌作用。6、MENK可通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路发挥抑制胃癌作用。


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