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基于网络药理学和肠道菌群测序分析葛根山药胶囊辅助降血糖功能的可能机制

孟贺  
【摘要】:目的:目前我国亚健康的人群已经达到了70%左右,糖尿病作为亚健康人群的高发病,已经成为继癌症、心脑血管病之后的又一大健康杀手。一旦患病,只能加以控制并终生用药,给患者带来了一定的经济负担。糖尿病还会导致糖尿病足、糖尿病眼病、糖尿病肾病等心血管方面严重的并发症,这也是糖尿病患者死亡的主要原因。鉴于糖尿病及其并发症的严重后果以及目前亚健康人群的现状,如果能服用一些保健食品加以辅助或预防,无疑是防止病发的有效手段。同仁堂牌葛根山药胶囊(Gegen Yam Capsule,GYC)是已经上市的并具有很好的辅助降血糖功能的中药复方保健食品(国食健字G20141226)。全方由葛根、山药、黄芪、生地黄四味中药材组成。四味药材配伍温和、清热润燥、养阴生津,适合血糖偏高者,但其降血糖的机制尚不明确。中药材具有成分众多、机制复杂的作用特点,单成分、单靶点的来研究中药也很难体现中药的系统性。近年来,网络药理学对中药多成分多靶点多通路的研究手段逐渐引起人们的重视,很多中药也通过网络药理学分析出了其作用机制。肠道菌群与代谢病,尤其是与糖尿病之间的关系也越来越成为研究的热点,已有文献报道肠道菌群代谢产生的一些产物可以影响血糖的高低。本文以葛根山药胶囊为例,应用网络药理学和肠道菌群测序的方法分析其发挥辅助降血糖功能的可能机制。方法:1,GYC对高血糖模型大鼠的辅助降血糖功能评价:构建胰岛损伤高血糖大鼠模型,分成Control组、Model组以及GYC组,测定各组实验动物空腹血糖值、给予葡萄糖后0.5、2h血糖值,并测定其血清中的胰岛素含量,计算胰岛素抵抗指数。2,网络药理学方法分析GYC辅助降血糖功能的可能机制:首先,应用在线数据库TCMSP等筛选GYC的潜在活性成分,同时应用文本挖掘等方法补充不在筛选条件之内但已明确报道具有降糖降脂作用的成分。应用TCMSP和DrugBank等数据库筛选与入选的成分相关的靶点。应用Cytoscape3.2.1软件构建成分、靶点之间的网络图,显示成分、靶点之间的网络关系。将靶点上传至David在线数据库,进行基因本体生物学过程(GO)和KEGG信号通路富集分析。基于网络药理学预测的结果,用Western Blot和Real-time PCR方法测定各组动物胰腺组织中代表性靶点PI3K、Akt、GSK-3β、PTGS2、TNFα、NFκB、TLR4的蛋白和mRNA水平的相对变化。3,肠道菌群测序分析GYC辅助降血糖功能的可能机制:对各组实验动物的肠道菌群进行16SrDNA的测序,观察各组动物肠道菌群的组成和相对丰度的变化,测定各组血清中LPS的含量。将菌群相对丰度改变较为突出的菌群与各组对应的空腹血糖值进行皮尔逊相关分析,考察动物血糖与菌群相对丰度间的相关性。结果:1,GYC对高血糖模型大鼠具有降血糖作用:与Control组比,Model组动物空腹血糖、0.5h、2h血糖值、血糖变化曲线下面积AUC升高显著(P0.01);与Model组比较,GYC组空腹血糖、0.5h、2h血糖值、血糖变化曲线下面积AUC下降显著(P0.01),其中各组0.5h血糖值均为最高值。与Control组比较,Model组胰岛素抵抗指数升高显著(P0.01),GYC组与Model组比较胰岛素抵抗指数下降显著(P0.01)。2,基于网络药理学分析GYC的结果:四味中药材共筛选出75个活性成分,对应286个靶点。潜在活性成分degree值较高的主要有葛根素、尿囊素、芒柄花素、槲皮素、山奈酚等。代表性靶点蛋白主要有PI3K、Akt、GSK-3β、PTGS2、PTGS1、TNFα等。富集到的生物过程320个,涉及糖脂代谢相关过程,免疫炎症相关过程,神经系统相关过程和其他四大类。KEGG富集到106条信号通路,涉及糖脂代谢相关通路,免疫炎症相关通路,病原微生物相关通路,神经系统相关通路,癌症和其他6大类。其中,糖脂代谢信号通路占比14%,免疫炎症相关信号通路占比8%。3,GYC的活性成分对应的糖脂代谢相关靶点的验证:与Control组比较,Model组PI3K、Akt、p-Akt蛋白的相对表达含量下降明显(P0.01),GSK-3β蛋白的相对表达水平升高显著(P0.01);与Model组比较,GYC组的PI3K、Akt蛋白的相对表达含量升高明显(P0.01),GSK-3β蛋白的相对表达水平下降显著(P0.01),mRNA水平检测结果与以上蛋白相对表达水平变化一致。4,GYC的活性成分对应的免疫炎症相关靶点的验证:Model组与Control组比较,PTGS2、TNFα、NFκB、TLR4蛋白的相对表达含量均升高显著(P0.01),GYC组与Model组比较,上述蛋白的相对表达含量下降显著(P0.01)。5,GYC对高血糖模型大鼠肠道菌群的改善作用:在属水平上,菌群相对丰度改变明显的主要有支原体菌属、乳酸菌属、链球菌属、大肠志贺氏菌属。Model组与Control组比较,支原体菌属、链球菌属、大肠志贺氏菌属的相对丰度呈现出上升趋势,乳酸菌属相对丰度是下降的。GYC组与模型组比较,支原体菌属、链球菌属、大肠志贺氏菌属的相对丰度是下降的,乳酸菌属相对丰度是上升的。同时,Model组与Control组比较,血清LPS水平升高显著(P0.01),GYC组与Model组比较,血清LPS水平下降显著(P0.01)。6,GYC降血糖作用与差异肠道菌群菌属的相对丰度相关:相关性分析结果显示,空腹血糖值与乳酸杆菌属相对丰度呈现负相关关系(P0.01),空腹血糖值越高,乳酸杆菌属相对丰度则越低。空腹血糖值与支原体菌属、链球菌属、大肠志贺菌氏菌属的相对丰度呈现正相关性关系(P0.01),空腹血糖值越高,则上述三种菌属相对丰度越高。结论:1,网络药理学分析结果显示:升高PI3K、Akt蛋白和mRNA相对表达水平、降低GSK-3β蛋白和mRNA相对表达水平可能是葛根山药胶囊的降血糖作用机制之一;降低TLR4、NFκB、PTGS2、TNFα的蛋白相对表达水平,可能是葛根山药胶囊的降血糖作用机制之一。2,肠道菌群测序分析结果显示:升高乳酸菌属相对丰度,降低支原体菌属、链球菌属、大肠志贺氏菌属的相对丰度,并降低血清中LPS的水平,可能是葛根山药胶囊的降血糖作用机制之一。


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