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趋化因子CXCL1调控APP/PS1小鼠神经干细胞增殖与分化的机制研究

商宇  
【摘要】:背景与目的 阿尔茨海默病是一种退行性脑病,也是痴呆症的最常见病因。在阿尔茨海默病中,执行认知功能的神经元的损伤导致痴呆症的发生;在晚期执行基本身体功能的神经元也会损伤,从而导致患者卧床不起,最终死于各种并发症。CXCL1是一种重要的趋化因子。在患有早期与非常早期阿尔茨海默病的患者的脑脊液中,CXCL1升高并且被认为是早期联合诊断阿尔茨海默病的指标之一。APP/PS1小鼠表达突变型人类早老素和突变型人淀粉样蛋白前体,是阿尔茨海默病经典的动物模型。在APP/PS1小鼠的脑脊液,CXCL1是否如在人类患者中一样出现异常改变?该问题尚无明确报导。在外周组织中,CXCL1主要由血管内皮细胞、活化的巨噬细胞和成纤维细胞表达和分泌。在脑组织中,CXCL1可以被神经元,小胶质细胞、少突胶质细胞和活化的星形胶质细胞表达和分泌。我们的前期研究发现高表达CXCL1的单核细胞参与APP/PS1小鼠血脑屏障的破坏,提示CXCL1可能参与阿尔茨海默病的发病,因此有必要阐明CXCL1的脑中来源。在本研究中,我们通过体内的免疫荧光共定位分析与体外的炎症细胞活化实验分析了在阿尔茨海默病中脑组织细胞分泌CXCL1的情况。神经干细胞具有两种基本能力:首先是自我更新,神经干细胞可以通过对称分裂和不对称分裂形成后代神经干细胞;其次是分化能力,神经干细胞可以分化为星形胶质细胞、神经元及少突胶质细胞。在成年哺乳动物中枢神经系统中,侧脑室的脑室下区和海马齿状回的颗粒下层是神经干细胞生存的微环境。脑室下区的神经干细胞可以通过细胞突起直接与脑脊液接触,脑脊液中含有很多对于维持神经干细胞自我更新及神经生成发挥重要作用的生长因子,如EGF、FGF-2等。脑脊液中的CXCL1是否会对位于室管膜下层的神经干细胞的生物学行为产生影响?为了阐明这个问题,我们通过细胞增殖实验等手段分析了CXCL1对神经干细胞增殖与分化的影响。生理浓度的活性氧作为重要的第二信使调节各种细胞内信号通路。内源性活性氧主要来源于线粒体途径与NADPH氧化酶途径。NADPH氧化酶家族由七个成员组成,NOX1-5、Doux1和Doux2。内源性产生的活性氧与神经干/祖细胞的增殖有密切关系。为了阐明CXCL1与神经干细胞活性氧生成的关系,我们分析了CXCL1对神经干细胞活性氧生成及活性氧下游相关信号通路的作用。方法 一、APP/PS1小鼠脑脊液CXCL1检测 通过PCR法鉴定APP/PS1小鼠的基因型。通过小鼠延髓池穿刺的方法获得4月龄、8月龄与12月龄APP/PS1小鼠与同窝野生型小鼠的脑脊液,用ELISA法检测CXCL1。二、12月龄APP/PS1小鼠CXCL1细胞来源的分析 免疫荧光检测CXCL1与神经元标记物MAP2、星形胶质细胞标记物GFAP、巨噬细胞标记物F4/80的共定位情况。三、巨噬细胞与小胶质细胞活化后合成与分泌CXCL1检测 LPS与ATP单独或联合应用刺激巨噬细胞系RAW264.7与小胶质细胞系BV2,收集细胞培养上清,ELISA法检测CXCL1;提取细胞总RNA,实时荧光定量PCR法检测CXCL1mRNA表达。四、CXCL1在体外对神经干细胞增殖的影响 通过WST-8法检测CXCL1对神经干细胞细胞活力的影响。实验包括对照组、CXCL1低剂量组与CXCL1高剂量组,细胞活力检测持续四天。 通过BrdU掺入实验进一步分析CXCL1在体外对神经干细胞增殖的影响。实验包括对照组、CXCL1低剂量组与CXCL1高剂量组。细胞培养24小时后通过免疫荧光实验观察BrdU与Nestin双阳性细胞,计算百分比。六、CXCL1在体内对神经干细胞增殖的影响 实验包括对照组、CXCL1低剂量组与CXCL1高剂量组。注射CXCL1于野生型小鼠侧脑室,腹膜内注射BrdU标记增殖神经干细胞。7天后,取脑,固定,振荡切片。免疫荧光实验检查侧脑室室管膜下层BrdU与Nestin双阳性细胞,计算数量。七、CXCL1在体外对神经干细胞分化的影响 实验包括对照组、CXCL1低剂量组与CXCL1高剂量组。神经干细胞向星形胶质细胞定向分化培养6天后,通过免疫荧光实验观察GFAP阳性细胞、MAP2阳性细胞、Nestin阳性细胞,计算百分比。通过免疫印迹实验检查神经干细胞GFAP与Tuj1的表达。七、CXCL1在体外对神经干细胞活性氧生成的影响 实验包括对照组、CXCL1低剂量组与CXCL1高剂量组。Hoechst 33342染色细胞核,H2DCFDA法标记细胞内产生的活性氧,计算细胞平均荧光强度。免疫印迹法检测细胞NOX2/gp91phox蛋白表达。八、CXCL1作用的细胞内信号通路研究免疫印迹法检测细胞Akt与Stat3蛋白磷酸化。九、动物体内抑制活性氧产生对CXCL1作用的影响 实验设10%DMSO组、CXCL1组与Apocynin plus CXCL1组。注射CXCL1与Apocynin于野生型小鼠侧脑室,腹腔内注射BrdU标记增殖神经干细胞。7天后,取脑,固定,振荡切片。免疫荧光实验检查侧脑室室管膜下层BrdU与Nestin双阳性细胞,计算数量。十、CXCL1对神经干细胞线粒体膜电位的影响实验包括对照组、CXCL1低剂量组与CXCL1高剂量组。JC-1染色法检查神经干细胞线粒体膜电位。结果 一、12月龄APP/PS1小鼠脑脊液中CXCL1高于同窝野生型小鼠,并且高于4月龄成年APP/PS1小鼠二、CXCL1在12月龄APP/PS1小鼠脑中共定位于神经元与巨噬细胞,与星形胶质细胞没有明显共定位。三、活化巨噬细胞合成与分泌更多的CXCL1,而活化小胶质细胞合成与分泌CXCL1没有变化。 RAW264.7细胞被LPS活化后CXCL1的mRNA表达与蛋白分泌增加明显,LPS与ATP联合刺激RAW264.7细胞比单独用LPS刺激更能促进CXCL1的合成与分泌。LPS与ATP的刺激对BV2细胞合成与分泌CXCL1没有明显影响。四、CXCL1促进体外神经干细胞的增殖 WST-8实验表明,与对照组相比,CXCL1(100ng/mL)处理的神经干细胞活力在3天、4天明显增加。与对照组相比,CXCL1(10ng/mL)处理的神经干细胞活力在4天明显增加。 BrdU掺入实验表明,CXCL1(100ng/mL)处理24小时后,BrdU与Nestin双阳性细胞占总细胞百分比明显增加。与对照组相比,CXCL1低剂量组BrdU与Nestin双阳性细胞占总细胞百分比没有明显改变。五、CXCL1在体内促进室管膜下区神经干细胞增殖 给与高剂量CXCL1后,小鼠脑室下区BrdU与Nestin双阳性细胞数量明显增加。给与低剂量CXCL1后,BrdU与Nestin双阳性细胞数量没有明显改变。六、CXCL1抑制体外神经干细胞分化为星形胶质细胞 在分化培养第六天,与对照组相比,CXCL1高剂量组的GFAP阳性细胞占总细胞比例明显降低,MAP2阳性细胞占总细胞比例没有明显差异,Nestin阳性细胞占总细胞比例亦没有明显差异。CXCL1低剂量组细胞比例与对照组相比没有明显差异。免疫印迹实验提示,CXCL1(100ng/mL)处理导致神经干细胞GFAP表达降低。七、CXCL1通过增加NOX2/gp91phox表达促进神经干细胞中活性氧的生成给与CXCL1(100ng/mL)后,与对照组相比神经干细胞平均荧光强度明显增加,但是CXCL1(10ng/mL)对神经干细胞平均荧光强度没有明显影响。给与CXCL1(100ng/mL)后,与对照组相比神经干细胞NOX2表达增加,CXCL1(10ng/mL)对神经干细胞NOX2表达没有明显影响。说明CXCL1通过NADPH氧化酶途径促进活性氧生成。八、CXCL1增加神经干细胞Akt磷酸化,而对Stat3磷酸化没有影响给与CXCL1(100ng/mL)后,在第12小时与第24小时,与对照组相比神经干细胞pAkt/Akt明显增加,但是CXCL1(10ng/mL)对神经干细胞pAkt/Akt没有明显影响。给与CXCL1(100ng/mL、10ng/mL)后,在第12小时与第24小时,与对照组相比神经干细胞pStat3/pStat3没有明显改变。九、在动物体内抑制活性氧的生成能够阻断CXCL1促进神经干细胞增殖的作用与仅给与高剂量CXCL1的小鼠相比,给予Apocynin与高剂量CXCL1的小鼠室管膜下区BrdU与Nestin双阳性细胞数量明显减少。与仅给与10%DMSO的小鼠相比,给予Apocynin与高剂量CXCL1的小鼠室管膜下区BrdU与Nestin双阳性细胞数量没有明显的改变。十、CXCL1不影响神经干细胞的线粒体膜电位。给与CXCL1(100ng/mL、10ng/mL)后,在第24小时,与对照组相比神经干细胞线粒体膜电位没有明显改变。结论 在阿尔茨海默病中,神经元与活化巨噬细胞来源的CXCL1能够通过脑脊液作用于位于室管膜下层的神经干细胞,通过NOX2-ROS-PI3K/Akt途径促进神经干细胞的增殖并抑制神经干细胞向星形胶质细胞分化,从而发挥保护作用。


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