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TGF-β3通过Lgl2调节大鼠血睾屏障及睾丸支持细胞乳酸分泌功能的机制研究

徐荧  
【摘要】:目的:在哺乳动物生精上皮中,睾丸支持细胞(Sertoli细胞)在精子发生过程中发挥着重要作用。相邻Sertoli细胞通过胞间连接形成血睾屏障(BTB),将生精上皮分隔成与生精小管上皮基膜相近的基底小室和连接生精小管管腔的近腔小室,为精子的形成创造了一个免疫豁免的微环境。在生精上皮周期的VIII期,前细线期精母细胞从基底室向近腔室的迁移涉及精母细胞移行后方新BTB复合体的构建和移行前方原有BTB复合体的分解。由Sertoli细胞和生精细胞分泌的转化生长因子-β3(TGF-β3)已被证实能够通过多种途径引起BTB屏障功能损坏,促进生精细胞迁移,但其调控BTB屏障功能的分子机制尚未被完全阐明。本课题组前期通过基因芯片筛选出TGF-β3作用前后Sertoli细胞中差异表达的microRNAs(miRNAs),其中miR-142-3p已被证实在多种细胞活动中参与了TGF-β介导的信号转导通路。我们前期通过生物信息学软件预测miR-142-3p能够特异性结合幼虫巨大致死性基因(Lgl)哺乳动物同源物Lgl2,推测miR-142-3p可能通过靶向Lgl2影响TGF-?3诱导的BTB屏障功能损伤。本研究第一部分旨在通过体内外BTB屏障功能研究进一步确定miR-142-3p对TGF-β3诱导的BTB屏障功能改变的调节作用,并探究其分子机制。乳酸是雄性生殖细胞的主要供能物质,在生精细胞能量代谢及精子发生过程中具有重要作用。Sertoli细胞除了通过形成BTB参与精子发生外,还是睾丸中乳酸的主要来源,其糖代谢模式类似肿瘤细胞中普遍存在的“Warburg效应”,能够通过高通量的有氧糖酵解分泌大量乳酸,为生精细胞提供能量及营养支持。TGF-?能够促进多种肿瘤和非肿瘤细胞的有氧糖酵解及乳酸分泌,但其作用机制尚不完全清楚。本研究第二部分在第一部分的研究基础上,探索了TGF-?3对Sertoli细胞糖代谢及乳酸分泌功能的调控作用,并探究其分子机制。方法:1、采用激光捕获显微切割(LCM)收集大鼠生精上皮周期不同阶段的生精小管外周细胞层,采用实时荧光定量PCR(qPCR)和免疫印迹检测TGF-?3、miR-142-3p、Lgl2的表达水平。2、体外培养大鼠原代Sertoli细胞,使用miRNA mimic过表达miR-142-3p后,使用重组人TGF-?3处理细胞24h。于不同时间点采用跨上皮电阻测定和荧光素钠通透率测定检测Sertoli细胞通透性;采用免疫沉淀和免疫印迹检测Cdc42、Cdc42-GTP、occludin、TGF-?3 I型受体的蛋白表达水平;采用免疫荧光检测occludin的分布。3、大鼠睾丸内注射agomiRNA过表达miR-142-3p后,注射重组人TGF-?3。于不同时间点采用生物素通透实验检测BTB通透性;采用qPCR检测miR-142-3p表达水平;采用免疫印迹检测occludin蛋白表达水平。4、在Lgl2基因中miR-142-3p的预测结合位点上构建突变序列,采用荧光素酶报告基因实验验证miR-142-3p对Lgl2的靶向结合作用。在大鼠原代Sertoli细胞中增加或抑制miR-142-3p表达后,分别采用免疫印迹和qPCR检测Lgl2的蛋白和mRNA表达水平。5、体外培养大鼠原代Sertoli细胞,使用miRNA mimic过表达miR-142-3p后,使用重组人TGF-?3处理细胞24h,采用qPCR和免疫印迹检测Lgl2表达水平。6、体外培养大鼠原代Sertoli细胞,使用siRNA沉默Lgl2后,使用重组人TGF-?3处理细胞24 h。于不同时间点采用跨上皮电阻测定和荧光素钠通透率测定检测Sertoli细胞通透性;采用免疫沉淀和免疫印迹检测Cdc42、Cdc42-GTP、occludin、Lgl2水平;采用免疫荧光检测occludin的分布改变。7、体外培养大鼠原代Sertoli细胞和TM4小鼠Sertoli细胞系,使用不同浓度重组人TGF-?3处理细胞6-24 h。检测细胞乳酸分泌量、葡萄糖消耗量、乳酸脱氢酶(LDH)活性、谷氨酰胺(Gln)消耗量、谷氨酰胺酶(Gls)活性及线粒体活性;采用免疫印迹检测细胞糖代谢和主要信号通路相关蛋白的表达改变。8、体外培养大鼠原代Sertoli细胞和TM4细胞,使用siRNA沉默Lgl2后,使用重组人TGF-?3处理细胞24 h。检测细胞乳酸分泌量、葡萄糖消耗量、LDH活性、Gln消耗量、Gls活性及线粒体活性;采用免疫印迹检测细胞糖代谢和主要信号通路相关蛋白的表达改变。9、体外培养大鼠原代Sertoli细胞和TM4细胞,使用siRNA沉默Lgl2后,使用Notch信号通路抑制剂DAPT处理细胞48 h。检测细胞乳酸分泌量、葡萄糖消耗量、LDH活性及线粒体活性;采用免疫印迹检测细胞糖代谢和Notch信号通路相关蛋白的表达改变;并于不同时间点采用跨上皮电阻测定检测大鼠原代Sertoli细胞的通透性。10、采用免疫组化观察Jagged1在大鼠生精上皮周期不同阶段的表达水平,并采用LCM收集大鼠生精上皮周期不同阶段的生精小管外周细胞层,采用qPCR检测Jagged1 mRNA的表达水平。11、大鼠睾丸内每日注射重组大鼠Jagged1,连续注射三天,在注射完成后的第3、5、10、20天分别采用HE染色观察精子发生情况。结果:1、在生精上皮周期各阶段中TGF-β3与miR-142-3p均具有完全相反的表达趋势,其中在VII-VIII期TGF-β3表达水平达到最高,同时期miR-142-3p表达水平降至最低。Lgl2蛋白表达水平在VIII期后出现明显下降,其mRNA表达水平随后在IV-IV期显著降低。2、miR-142-3p过表达能够显著抑制TGF-β3诱导的Sertoli细胞屏障功能减退、Cdc42活性升高和occludin表达降低。3、miR-142-3p过表达能够显著抑制TGF-β3诱导的大鼠睾丸内BTB屏障功能减退和occludin表达降低。4、miR-142-3p能够靶向结合Lgl2的3'UTR,并在翻译水平抑制Lgl2的蛋白表达。5、TGF-β3处理能够显著增加Sertoli细胞中Lgl2蛋白的表达水平,miR-142-3p能够抑制TGF-β3诱导的Lgl2蛋白表达升高。6、沉默Lgl2能够部分拮抗TGF-β3诱导的Sertoli细胞屏障功能减退及occludin表达降低,但对Cdc42表达及活性均无明显影响。7、TGF-β3处理能够抑制Sertoli细胞线粒体活性,促进Sertoli细胞糖酵解、Gln分解代谢及乳酸分泌,并能够在Sertoli细胞中激活MAPK信号通路,抑制Akt和Notch信号通路。8、在Sertoli细胞中沉默Lgl2能够拮抗TGF-β3对线粒体和Notch信号通路的抑制作用以及TGF-β3对糖酵解和乳酸分泌的促进作用,但不改变TGF-β3对Gln分解代谢及Akt、MAPK信号通路的影响。9、在Sertoli细胞中抑制Notch信号通路能够拮抗Lgl2沉默引起的线粒体活性增强、糖酵解减弱和乳酸分泌减少,但不影响Sertoli细胞通透性。10、Jagged1在大鼠生精上皮周期各阶段均表现出与TGF-?3相反的表达趋势。11、重组Jagged1介导的Notch信号通路活化引发可逆性大鼠精子发生障碍。结论:1、miR-142-3p能够通过靶向Lgl2抑制TGF-β3诱导的BTB屏障功能损伤。2、TGF-?3能够通过上调Lgl2的表达抑制Notch信号通路活性,从而促进Sertoli细胞的有氧糖酵解及乳酸分泌。


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