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Orexin-A通过Orexin 1 Receptor和Orexin 2 Receptor引起创伤后应激障碍大鼠记忆异常机制的研究

韩丹  
【摘要】:目的:创伤后应激障碍(Post-traumatic stress disorder,PTSD)是一种指个体经历、遭遇或目睹到涉及自身或他人危及生命的应激性事件或处境所导致的个体延迟出现和持续存在的精神障碍。研究发现PTSD患者记忆障碍,以及与应激紧密相关的下丘脑-垂体-肾上腺(The hypothalamic–pituitary–adrenal axis,HPA)轴功能异常。前额内侧皮质(medial prefrontal cortex,mPFC)和海马是大脑边缘系统的重要组成部分,在学习与记忆,情感调节等方面发挥重要的作用,目前研究发现mPFC与海马功能及结构异常与多种精神疾病发病有关。mPFC位于海马的上游,协同海马共同控制HPA轴的活性。影像学研究发现PTSD患者海马和mPFC体积改变。运用超微结构技术发现PTSD大鼠海马、mPFC等部位神经元发生凋亡,内质网应激途径、线粒体途径导致了神经元程序化死亡。mPFC调节海马及其下游的HPA轴活性构成应激作用的环路,参与调节记忆及其相关功能的调节。所以mPFC,海马和下丘脑的异常可能与PTSD患者记忆异常及所产生的焦虑、抑郁、回避、麻木的情感调节障碍中密切相连。Orexins,又称为hypocretins,是一对由下丘脑神经元产生多肽,包括orexin-A和orexin-B(即hypocretin-1,hypocretin-2),因其有促进摄食作用,被译为食欲素。orexin神经元广泛投射脑组织各部位,通过orexin 1 receptor(OX1R)和orexin 2 receptor(OX2R)两种受体发挥作用。研究发现orexins与大脑摄食中枢关系密切,可以促进摄食行为;OX1R\OX2R在海马及mPFC表达,参与orexin调控记忆学习等功能。本研究通过三种行为学实验,Morris水迷宫(morris water maze,MWM),高架十字迷宫(elevated plus maze test,EPM)及旷场实验(Open field test,OFT)检测PTSD大鼠空间学习记忆异常、焦虑程度和自发性探索行为。并利用电镜来证明PTSD大鼠下丘脑、海马、mPFC神经元超微结构的异常改变,为进一步揭示PTSD发病机制提供神经结抅基础。从形态学,蛋白水平,基因水平来探索orexin-A及其受体OX1R、OX2R在PTSD大鼠下丘脑、海马、mPFC的表达变化,结合生理指标测定,研究orexin-A及其受体OX1R、OX2R参与PTSD大鼠记忆、应激反应与情感障碍的病理生理过程,为深入揭示PTSD的发病机制提供依据。给予PTSD大鼠侧脑室注射orexin-A,通过Morris水迷宫观察大鼠学习与记忆的变化,在蛋白水平检测OX1R、OX2R,为orexin-A是否具有治疗PTSD的潜力及其治疗机制提供理论依据。研究方法:1、动物模型制作、实验分组及生理指标测量:第一、二部分:取健康雄性6周-7周Wistar大鼠共120只,随机分为连续单一刺激(Single prolonged stress,SPS)模型1d、4d、7d、14d和正常对照组,每组24只。观察各组大鼠的精神状态,记录实验0、7、14天大鼠体重,0~7d、7~14d食物量,比较SPS模型组与正常对照组大鼠体重增长、食物量变化情况。第三部分:用6周-8周龄雄性Wistar大鼠共32只,体重(200±30)g,随机分为4组,SPS+vehicle、SPS+orexin-A、non-SPS+vehicle、non-SPS+orexin-A,每组8只。2、行为学测定:通过行为学实验,MWM、EPM及OFT检测PTSD大鼠空间学习记忆异常、焦虑程度和自发性探索行为。3、透射电镜技术:利用透射电镜来证明PTSD大鼠下丘脑、海马、mPFC神经元超微结构的异常改变。4、免疫组织化学:应用免疫组织化学方法,从形态学角度观察下丘脑orexinA、OX1R、OX2R,海马OX1R、OX2R,mPFC OX1R免疫表达变化。5、Western blotting:应用Western blotting方法检测各组大鼠下丘脑、海马、mPFC部位OX1R、OX2R蛋白表达变化。6、Real-Time PCR:应用Real-Time PCR方法检测各组大鼠下丘脑orexin-A和OX1R、OX2R mRNA的表达变化;海马、mPFC部位OX1R、OX2R mRNA的表达变化。结果:1、大鼠生理指标的测量:发现与正常组对照,SPS大鼠体重增长速度减慢,在实验7~14天阶段,与正常组对照,SPS大鼠食量明显减少。2、行为学检测结果:MWM空间探索实验中,与正常组对照,SPS组大鼠在目标象限游泳距离/总距离的百分比和穿越目标象限次数明显减少;EPM实验中,SPS7d组大鼠在开放臂运动行为较少,与正常组大鼠对比,SPS7d组大鼠在开放臂行走距离,穿越次数、停留时间减少,在闭合臂行走距离和进入次数也是减少的,但停留时间增加;OFT实验中,与正常组对比,SPS7d组大鼠在中央区域活动减少,中央区域的行走距离,进入次数,停留时间,后肢站立次数,以及外周区域的进入次数,后肢站立次数均是减少的,而在外周区域停留时间是增加的。给予SPS大鼠侧脑室注射orexin-A后,行MWM空间探索实验,SPS+orexin-A组目标象限游泳距离/总距离的百分比及穿越目标象限次数均高于SPS+vehicle组。说明给予SPS大鼠orexin-A后,空间记忆能力损伤有明显改善。3、透射电镜超微结构:透射电境下,正常组大鼠下丘脑、海马、mPFC的神经元细胞核染色质均匀分布,核仁、胞膜完整,细胞器结构正常。SPS刺激后,下丘脑和海马神经元细胞核染色质分布不均,出现染色质边集;mPFC神经元粗面内质网明显扩张。4、免疫组织化学检测:给予大鼠SPS刺激后,orexin-A、OX1R、OX2R免疫阳性产物呈棕黄色,分布在神经元细胞质中。随着实验进行,下丘脑orexin-A表达逐渐减弱;OX1R表达在下丘脑,海马,mPFC均逐渐增强;OX2R表达在海马逐渐增强,而在下丘脑和mPFC,OX2R表达各实验组无差异。5、Western bloting检测结果:SPS刺激后,OX1R蛋白表达在下丘脑,海马和mPFC三个部位均逐渐增多;OX2R在海马蛋白表达逐渐增多,在下丘脑和mPFC,OX2R虽有一定表达,但各实验组无明显统计学差异。给予SPS大鼠侧脑室注射orexin-A后,与SPS+vehicle组对比,SPS+Orexin-A组在下丘脑、海马和mPFC,OX1R蛋白水平降低;而OX2R在海马部位蛋白表达降低,但在下丘脑和mPFC,OX2R表达无统计学差异。6、Real Time PCR检测结果:给予SPS刺激后,结果显示下丘脑orexin-A mRNA表达水平逐渐减弱;OX1R mRNA在下丘脑、海马和mPFC表达均逐渐增多;OX2R mRNA在海马表达逐渐增多,而在下丘脑及mPFC无差异。结论:1、SPS大鼠出现摄食量减少,体重增长缓慢,空间记忆降低,恐惧增强,探究行为减少和焦虑状态。PTSD大鼠下丘脑、海马、mPFC神经元超微结构出现异常改变。2、SPS刺激后,下丘脑、海马和mPFC部位orexin-A及其受体的异常变化可能与PTSD大鼠摄食减少,记忆功能受损和焦虑状态有关。3、侧脑室注射orexin-A部分逆PTSD大鼠受损的空间记忆及异常的orexin受体表达,这说明了orexin-A可能具有治疗PTSD的潜力。


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