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体外共培养体系中肝星状细胞分泌CCL5影响乳腺癌细胞生物学行为的研究

黄泓姗  
【摘要】:目的:乳腺癌在全球范围内的高发病率,已经严重威胁到了广大女性的健康。近年来,随着人们对乳腺癌的重视及乳腺癌的早期诊疗技术不断提高,使许多患者在早期就接受了规范化的治疗。目前的治疗方式包括局部治疗如手术和放疗,全身治疗如化疗、内分泌治疗、靶向治疗等。这种综合治疗方式显著的改善了大部分乳腺癌患者的预后和生活质量。然而肿瘤的远处器官转移依然是乳腺癌患者治愈之路上的最大阻碍。一旦发生,患者的生命受到巨大的威胁。其中,除骨、肺之外,乳腺癌还最容易转移到肝脏。但由于缺乏对治疗的敏感性,乳腺癌肝转移患者的预后较差。因此,针对乳腺癌肝转移的研究具有重要的意义。最早提出的“种子”“土壤”假说及之后经过修订的“种子”“土壤”假说均提出了这样一种观点,即肿瘤微环境在肿瘤转移的恶性进程中扮演者重要的角色。肝脏既然作为乳腺癌容易发生趋向转移的靶器官之一,其微环境对于肿瘤细胞无疑是适宜的。肝脏微环境的构成极其复杂,包括细胞组分和非细胞组分。其中,肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSCs)是一类间质细胞,在机体和肝脏处在健康状态下时,HSCs保持静止状态并发挥着重要作用。但当受到机械外力损伤、体内寄生虫感染或炎症等刺激时,HSCs则激活并发生表型的转变。激活的HSCs通过产生丰富的细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)及活性细胞因子等对肝脏微环境进行重塑。事实上,已有证据表明,在肝脏肿瘤微环境,HSCs通过多种方式发挥着重要的作用。同样,肿瘤细胞作为“外来物”,也能够激活HSCs,使HSCs发生表型转变并伴随分泌蛋白表达谱的变化,对ECM进行重塑,进而参与肿瘤的发生发展。但目前关于HSCs对乳腺癌细胞生物学行为所产生的影响尚缺乏相关研究,基于此,本研究从微环境角度出发,以细胞交互为切入点,针对HSCs对乳腺癌细胞生物学行为的影响进行了初步探索,为进一步明确乳腺癌肝转移的分子机制提供理论依据。方法:1、分别利用Transwell的培养小室,建立HSC和乳腺癌细胞的体外非接触式的共培养模型,以及根据实验目的收集HSC培养基上清制备条件培养基(Conditioned medium,CM)与乳腺癌细胞进行共培养;2、共培养后细胞的形态改变通过倒置显微镜进行观察;3、细胞增殖能力的变化分别采用CCK-8实验、EdU实验、克隆形成实验进行检测,并通过裸鼠体内荷瘤实验验证;4、采用经典的划痕实验检测细胞的迁移能力;5、采用Transwell明胶侵袭实验检测细胞的侵袭能力;6、采用RT-PCR法检测待测基因mRNA水平变化;7、采用Western bolt检测待测基因蛋白水平的变化;8、采用Elisa法检测细胞因子外分泌表达水平;9、采用Raybiotech公司QAH-CAA-1000细胞因子抗体芯片检测差异分泌的细胞因子;10、采用脂质体介导si RNA转染,干扰目的基因表达;11、采用DAVID Bioinformatics Resources 6.8软件对上调的细胞因子进行Gene Ontology(GO)分析;12、利用KEGG进行Pathway分析;13、利用KM-Plotter数据库进行预后分析,GEPIA在线数据平台进行相关性分析;14、统计学分析:SPSS 22.0软件用于分析实验的数据。数据采用均数(Mean)±标准误(Standard Deviation,SD)表示。Graphpad Prizm 6软件作图。t检验和one-way ANOVA检验分别进行两组间比较和多组间比较,P0.05代表有统计学意义。结果:1、乳腺癌细胞对HSCs的影响。HSCs LX-2与乳腺癌共培养之后其形态向肌成纤维细胞转变,并伴有HSCs活化的标记物α-SMA表达升高。这些结果表明乳腺癌细胞能够激活HSCs使其向肌成纤维细胞转变。2、活化的HSCs对乳腺癌细胞的影响。首先,收集LX-2 CM对乳腺癌细胞进行共培养,采用CCK-8、EdU及平板克隆形成实验检测体外乳腺癌细胞的增殖情况;采用裸鼠荷瘤实验进行体内验证,分别将乳腺癌细胞独立接种或与LX-2混合后接种,观察体内荷瘤情况。上述实验结果显示与活化的HSCs共培养后,乳腺癌细胞的增殖能力明显增强。随后,通过Transwell培养小室建立HSCs与乳腺癌细胞共培养模型,分别进行划痕实验以及Transwell侵袭实验,结果显示乳腺癌细胞无论其迁移能力还是侵袭能力,在与HSCs共培养后均明显增强。同时,我们进一步将HSCs与上皮型乳腺癌细胞进行Transwell共培养,结果显示luminal型的乳腺癌细胞形态像间质型细胞转变,并伴有EMT标记物表达的变化。由此,上述结果表明在HSCs与乳腺癌共培养的微环境中活化的HSCs能显著影响乳腺癌细胞的恶性生物学行为。3、HSCs与乳腺癌细胞的体外共培养体系中,CCL5是HSCs分泌的关键细胞因子。为进一步了解活化HSCs影响乳腺癌细胞生物学行为背后的分子机制,我们采用含80个细胞因子的抗体芯片对乳腺癌细胞单独培养体系及HSCs/乳腺癌细胞共培养体系中的差异细胞因子进行检测,并将筛选到的上调细胞因子进行包括GO分析和KEGG通路分析在内生物信息学分析。结果显示CCL5的含量在共培养组中明显升高。通过进一步验证后发现在共培养组和HSCs单独培养组中CCL5的含量明显高于肿瘤细胞组。生物信息学分析发现,CCL5和大部分上调的细胞因子参与的分子功能主要富集于蛋白结合、细胞因子活性和蛋白激酶活性等;生物学进程主要富集于正向调节ERK1和ERK2级联反应、正向调节细胞迁移、细胞间信号传递及信号转导等;其信号通路主要富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路及在许多肿瘤中均发现突变和激活的PI3K-Akt信号通路。通过上述结果,我们观察到在与乳腺癌细胞共培养后,激活的HSCs分泌CCL5增多,使共培养的微环境中CCL5含量显著增加。4、HSCs旁分泌的CCL5对乳腺癌细胞生物学行为的影响。为了阐明HSCs来源的CCL5对乳腺癌细胞的影响,我们采用si-RNA技术分别干扰了LX-2细胞和乳腺癌细胞MDA-MB-231 CCL5表达。CCK-8、迁移实验及侵袭实验发现,与si-CCL5/LX-2共培养后乳腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力明显下降,当再加入外源性CCL5刺激后(阳性对照组),乳腺癌细胞的这些恶性行为再次增强。此外,为了明确乳腺癌细胞自分泌的CCL5的作用,我们收集不同的LX-2 CM共培养si-CCL5/MDA-MB-231细胞。结果显示,对比空白对照组和si-CCL5/LX-2组,si-NC/LX-2组和si-CCL5/LX-2+CCL5组CM依然能够促进干扰了CCL5的乳腺癌细胞的增殖能力。同时,为了阐明CCL5是否能够通过与其配体CCR5结合发挥作用,我们首先明确了乳腺癌细胞的CCR5的表达情况,随后在siNC/LX-2与乳腺癌细胞的共培养体系(阴性对照组)中加入CCR5拮抗剂Maraviroc,结果显示乳腺癌细胞被CCL5增强的增殖、迁移及侵袭能力的均受到抑制。以上结果表明,HSCs来源的CCL5通过乳腺癌细胞表面的CCR5影响乳腺癌细胞的恶性表型。5、共培养体系中CCL5/CCR5轴影响乳腺癌细胞生物学行为的机制。利用KM-Plotter数据库分析CCR5对乳腺癌预后的影响,结果显示CCR5与乳腺癌的较短的总生存和无复发生存相关。同时,利用GEPIA数据库分析CCL5和CCR5是否存在相关性,结果显示CCL5与CCR5之间存在明显的正相关。结合之前GO分析及KEGG分析结果,我们发现CCL5参与了多种生物学进程,并可通过PI3K/Akt发挥功能。因此,结合上述结果,我们认为HSCs分泌的CCL5能够与乳腺癌细胞表面的CCR5结合形成CCL5/CCR5生物轴,并可通过PI3K-Akt信号通路影响乳腺癌细胞的恶性表型。结论:1、在HSCs与乳腺癌细胞的体外共培养体系中,乳腺癌细胞能够加剧HSC的活化并诱导HSCs向肌成纤维细胞转变;2、在HSCs与乳腺癌细胞的体外共培养体系中,活化的HSCs使乳腺癌细胞增殖能力、迁移能力和侵袭能力均得到增强,并发生EMT;3、在HSCs与乳腺癌细胞的体外共培养体系中,活化的HSCs分泌的CCL5是影响乳腺癌生物学行为的关键细胞因子;4、在HSCs与乳腺癌细胞的体外共培养体系中,活化的HSCs来源的CCL5通过乳腺癌细胞表面的CCR5对乳腺癌细胞的恶性表型起到促进作用;5、在HSCs与乳腺癌细胞的体外共培养微环境中,CCL5/CCR5轴可能通过PI3K/Akt通路对乳腺癌细胞恶性表型进行调控。


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