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基于胆汁酸代谢的丙戊酸肝毒性相关机制研究

陈亚南  
【摘要】:目的:丙戊酸(Valproic acid,VPA)为一线广谱抗癫痫药物(AED),可单独使用或联合其他AEDs治疗各种类型的癫痫。近年来因其抑制组蛋白去乙酰化酶(HDACs)活性而成为肿瘤治疗的辅助药物。鉴于VPA临床应用的广泛性,其严重不良反应肝毒性引起了临床医生的普遍关注。目前普遍认为VPA及其活性代谢产物通过抑制线粒体β氧化功能酶、消耗肉碱和辅酶A、引起氧化应激反应和高氨血症等途径导致肝脏毒性,然而VPA肝毒性机制仍然存在争议。代谢组学致力于研究生物体对药物干预、疾病、环境以及遗传修饰等因素影响的最终应答,为药物性肝损伤机制的探究以及生物标志物的筛选提供了新思路。本课题拟利用非靶向代谢组学技术检测VPA致肝功能异常癫痫患儿血清中代谢图谱的变化,筛选差异性代谢物,探寻差异性代谢通路,并在动物和细胞中进行相关机制研究。研究方法:1、VPA致肝功能异常癫痫患儿血清样本的收集:收集于中国医科大学附属盛京医院就诊的癫痫儿童(年龄≤16周岁)血清样本及病历信息,并根据肝功能指标将患儿分为肝功能正常(NLF)组和肝功能异常(ABLF)组;2、VPA致肝功能异常癫痫患儿血清中差异性代谢物和代谢通路的筛选:通过冰乙腈蛋白沉淀的方法对血清中代谢物进行提取,分别采用反相液相色谱(RPLC)和亲水性相互作用液相色谱(HILIC)两种分离模式进行色谱分离,并在电喷雾(ESI)正离子和负离子模式下进行检测。根据每种模式采集的数据,利用主成分判别分析(PCA-DA)、正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)等多元统计分析方法对内源性代谢物进行统计分析,根据变量重要性(VIP)≥1.0、模型与原始数据之间相关系数的绝对值(|p(corr)|)≥0.4以及两组样本间P0.05进行差异性代谢物的筛选,并对筛选后的差异性代谢物进行KEGG通路分析以匹配发生改变的代谢通路;3、VPA对小鼠肝脏胆汁酸谱的影响:C57B/6J雄性小鼠(体重20-22 g)每日灌胃250或500 mg/kg VPA溶液,对照组小鼠给予等体积的生理盐水(5 mL/kg),连续14天。通过肝功能生化指标检测和HE、油红O染色等肝脏组织病理学检测评估VPA对小鼠肝脏的毒性作用。基于HPLC-QTOF/MS的靶向胆汁酸谱检测技术对小鼠肝脏中18种胆汁酸进行定量分析,利用主成分分析(PCA)、OPLS-DA等多元变量统计分析方法进行统计分析,根据VIP≥1.2进行差异性胆汁酸的初步筛选,并采用单因素方差分析(ANOVA)或Kruskal–Wallis H检验对差异性胆汁酸进行组间差异分析。进一步对胆汁酸进行分类并做统计分析;4、VPA对胆汁酸代谢相关基因和蛋白表达的影响:使用Real-time PCR和Western Blot技术检测胆汁酸合成、转运和调节等相关基因和蛋白的表达变化;5、法尼酯X受体(FXR)在VPA肝毒性中的作用:不同浓度的VPA(0、1、2、5 mM)处理HepG2细胞24 h后,使用Real-time PCR、Western Blot和Immunoprecipitation等技术检测FXR、SHP、HDAC1、HDAC2、HDAC3以及乙酰化蛋白质的表达变化。利用FXR选择性激动剂GW4064(1μM)考察FXR的激动是否缓解VPA对HepG2细胞的毒性作用。结果:1、VPA致肝功能异常癫痫患儿血清中差异性代谢物和代谢通路的筛选:本研究共纳入23例服用VPA进行癫痫治疗的儿童患者,其中ABLF组13例,NLF组10例。通过PCA-DA分析,在不同的色谱系统和离子化模式下,ABLF和NLF两组患儿血清样品均明显区分,表明VPA致肝功能异常癫痫患儿血清代谢模式发生改变。通过单变量和多元变量统计分析,最终得到25种差异性代谢物。KEGG通路分析显示,ABLF组患儿血清中脂肪酸通路、氨基酸代谢、柠檬酸循环、尿素循环、胆汁酸通路等多条代谢通路发生改变;2、VPA对小鼠肝脏胆汁酸谱的影响:(1)经过不同剂量VPA(250和500 mg/kg)处理小鼠14天后,VPA处理组小鼠血浆中总胆固醇和肝脏甘油三酯显著增加,而血浆中肝酶活性(ALT、AST和ALP)无显著性变化。HE和油红O染色结果显示,VPA处理组小鼠肝脏出现脂质累积;(2)根据热图和非监督性的PCA模型(3个主成分,R~2X=0.944,R~2Y=0.797)分析发现,三组小鼠肝脏胆汁酸谱明显区分,胆汁酸稳态受到干扰;与对照组相比,500 mg/kg组小鼠肝脏中绝大部分胆汁酸显著增加,并且500 mg/kg组小鼠胆汁酸谱与对照组之间的差异显著大于250 mg/kg组小鼠胆汁酸谱与对照组之间的差异;(3)进一步建立OPLS-DA模型(R~2X=0.854,R~2Y=0.706,Q~2Y=0.549),R~2Y和Q~2提示模型的稳定性和预测性能较好,对胆汁酸数据进行200次置换检验后表明该模型未过度拟合;(4)根据VIP≥1.2筛选出与VPA肝毒性相关性较高的胆汁酸成分鹅脱氧胆酸(CDCA)和脱氧胆酸(DCA),经过ANOVA或Kruskal-Wallis H检验后,发现这两种胆汁酸呈VPA剂量依赖性增加,可能成为预测VPA肝毒性的潜在生物标志物;(5)500 mg/kg组小鼠肝脏中总胆汁酸和非结合胆汁酸显著增加;3、VPA对胆汁酸代谢相关基因和蛋白表达的影响:(1)Real-time PCR结果显示,VPA处理组尤其是500 mg/kg组,小鼠肝脏中胆汁酸合成酶(CYP7A1、CYP8B1和CYP7B1)和转运体(BSEP和MRP2)的基因表达显著增加,而调节蛋白(FXR和SHP)的基因表达显著降低,氨基酸结合酶(BAAT和BACS)的基因表达无显著性变化;(2)Western Blot结果显示,500 mg/kg组小鼠肝脏中胆汁酸合成酶(CYP7A1和CYP8B1)的蛋白表达显著增加,氨基酸结合酶(BAAT和BACS)和调节蛋白(FXR和SHP)的蛋白表达均显著降低,而转运体(BSEP和MRP2)的蛋白表达无显著性变化;4、FXR在VPA肝毒性中的作用:不同浓度的VPA(0、1、2、5mM)处理HepG2细胞24 h后,FXR、SHP和HDAC1-3的表达呈VPA浓度依赖性降低,蛋白质乙酰化水平增加,FXR选择性激动剂GW4064无法逆转VPA对FXR活性的抑制作用,并不能减轻VPA肝毒性。结论:1、VPA致肝功能异常癫痫患儿血清代谢模式发生改变,涉及脂肪酸通路、氨基酸代谢、柠檬酸循环、尿素循环、胆汁酸通路等多条代谢通路,其中胆汁酸稳态的干扰为首次发现;2、VPA通过影响胆汁酸的合成与结合进而干扰胆汁酸稳态,其中FXR介导的胆汁酸调节通路可能参与了VPA肝毒性的发生;3、通过GW4064激动FXR活性不能减轻VPA肝毒性,可能与FXR乙酰化修饰上调有关。


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