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肌动蛋白相关蛋白ACTR2通过FAK/Src-ERK1/2通路诱导EMT促进甲状腺乳头状癌侵袭及转移的分子机制研究

刘晨希  
【摘要】:目的:甲状腺乳头状癌(Papillary thyroid carcinoma,PTC),作为甲状腺癌中最常见的病理类型,其发病率逐年递增,且淋巴结转移率较高。探究PTC发生侵袭转移的相关分子机制对PTC的诊疗具有重要意义。肌动蛋白细胞骨架的重塑在肿瘤细胞侵袭转移过程中发挥重要作用。肌动蛋白相关蛋白Actin related protein 2(ACTR2)作为Arp2/3复合体中的重要亚基,是新肌动蛋白丝的成核位点,刺激肌动蛋白聚合,形成微丝,在肌动蛋白细胞骨架的重塑过程中不可或缺。至今为止,ACTR2被认为与许多恶性肿瘤密切相关,但其对PTC侵袭转移的具体影响尚不清楚。本课题针对ACTR2在PTC侵袭转移过程中的具体影响及其相关分子调控机制进行了详细研究和深入讨论。方法:1.收集中国医科大学附属盛京医院确诊的118例PTC患者的癌组织和对应的癌旁正常甲状腺组织。应用实时定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)、western blot蛋白免疫印迹、免疫组织化学染色(Immunohistochemistry,IHC)等方法检测ACTR2的mRNA及蛋白在PTC癌组织和对应癌旁正常组织中的表达情况,并分析ACTR2相对表达与PTC患者临床病理特征之间的关系。2.培养PTC细胞系,比较三株PTC细胞系(K1,TPC-1,BCPAP)与甲状腺滤泡上皮细胞(Nthy-ori3-1)中ACTR2的表达情况。通过慢病毒敲减及质粒过表达ACTR2基因,构建ACTR2稳定敲减(KD_(ACTR2))和稳定过表达(OE_(ACTR2))的PTC细胞株。通过MTS实验检测ACTR2基因对PTC细胞增殖能力的影响;划痕实验检测ACTR2对PTC细胞迁移能力的影响;Transwell实验检测ACTR2基因对PTC细胞侵袭能力的影响;碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染色法检测ACTR2基因对PTC细胞周期的影响;Annexin V-APC/7-AAD实验检测ACTR2基因对PTC细胞凋亡的影响。3.收集并整合GEO(Gene Expression Omnibus)数据库中PTC相关数据系列,通过GSEA(Gene Set Enrichment Analysis)分析预测ACTR2在PTC中的功能富集(Gene oncology,GO)和KEGG信号通路(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway)。通过western blot及MTS,划痕及Transwell等细胞功能学实验进一步检测ACTR2基因对下游信号通路及EMT相关蛋白表达的影响。结果:1.根据RT-qPCR,western blot及IHC结果显示:与癌旁正常组织相比,ACTR2mRNA及蛋白在PTC组织中的表达明显升高(P0.05)。与患者的临床病理特征关系的分析发现,ACTR2在PTC中的高表达与患者的肿瘤大小,肿瘤腺体外侵犯(extrathyroid extension,ETE)及发生淋巴结转移有关系(P0.05),而与患者的年龄,性别,肿瘤单/多发,位于单/双侧无关系(P0.05)。2.根据RT-qPCR和western blot结果显示:三株PTC细胞系中ACTR2的mRNA及蛋白表达明显高于Nthy-ori3-1(N3)细胞(P0.05)。MTS结果显示三株PTC细胞中KD_(ACTR2)组第五天的光密度(optical density,OD)值均明显降低(P0.05),而OE_(ACTR2)组第五天的OD值明显升高;划痕实验结果显示三株PTC细胞系中KD_(ACTR2)组迁移面积占划痕面积的比例明显减少,而OE_(ACTR2)组的比例明显升高(P0.05);Transwell实验结果示三株PTC细胞系中KD_(ACTR2)组的侵袭细胞数明显减少,而OE_(ACTR2)组的数量明显增多(P0.05)。各阴性对照组间差异无统计学意义(P0.05)。细胞周期实验示三株PTC细胞系各组间不同细胞周期占比均无差异。细胞凋亡实验结果显示各组间的细胞凋亡率无统计学差异(P0.05)。3.GSEA的GO分析结果显示,ACTR2可有效促进泌酸、转运氨基酸、形成动作电位、激活腺苷酸环化酶等生物过程的发生,而进一步的KEGG通路分析结果表明,ACTR2可促进钙信号、细胞粘附、趋化因子、细胞因子-细胞因子受体相互作用,造血细胞系途径相关信号通路的发生。Western blot验证显示三株PTC细胞中,改变ACTR2的表达对黏着斑激酶(Focal adhesion kinases,FAK),Src酪氨酸激酶(Src tyrosine kinase,Src),细胞外信号调节蛋白激酶1/2(Extracellular signal regulated kinases 1/2,ERK1/2)的表达无影响(P0.05),而过表达ACTR2后p-FAK,p-Src,p-ERK1/2的蛋白相对表达均明显升高,敲减ACTR2后,上述蛋白表达均明显降低。过表达ACTR2组中E-钙粘连蛋白(E-cadherin,E-cad)明显降低,而N-钙粘连蛋白(N-cadherin,N-cad)、波形蛋白(vimentin,VIM)及基质金属蛋白酶9(Matrix metalloprotein9,MMP9)均明显增高。在敲减ACTR2组中,E-cad明显增高,而N-cad,VIM及MMP9均明显降低(P0.05)。当OE_(ACTR2)组中加入FAK磷酸化抑制剂Y15(OE_(ACTR2)+Y15)后,western blot结果提示,与OE_(ACTR2)组相比,OE_(ACTR2)+Y15组的ACTR2、FAK,Src,ERK1/2的表达无差异,但p-FAK,p-Src,p-ERK1/2均明显降低(P0.05)。相较于OE_(ACTR2)组,OE_(ACTR2)+Y15组中E-cad明显增高,而N-cad,VIM及MMP9均明显降低。MTS结果显示三株PTC细胞中OE_(ACTR2)+Y15组第五天的OD值明显低于OE_(ACTR2)组;划痕实验结果显示三株PTC细胞系中OE_(ACTR2)+Y15组迁移面积占划痕面积的比例明显少于OE_(ACTR2)组;Transwell实验结果示三株PTC细胞系中OE_(ACTR2)+Y15组的侵袭细胞数明显少于OE_(ACTR2)组,其余各阴性对照组间差异无统计学意义(P0.05)。结论:1.ACTR2的mRNA及蛋白在PTC癌组织中均高表达,且与PTC的肿瘤大小,ETE及淋巴结转移有关系。2.ACTR2的mRNA及蛋白在PTC细胞中高表达,参与调控了PTC细胞的增殖、迁移与侵袭,但对细胞周期及凋亡无影响。3.ACTR2可通过FAK/Src-ERK1/2信号通路诱导EMT的发生,进而促进P TC细胞发生侵袭及转移。


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