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特异性下调内质网分子伴侣GRP94对人大肠癌细胞生物学特性影响的研究

陈瑶  
【摘要】:目的 内质网是真核细胞中特化的膜性细胞器,与蛋白质、脂类的合成密切相 关,而且还是细胞内Ca2+的重要储库。因此研究内质网的微细结构,尤其 是ER合成的膜蛋白、分泌蛋白和分子伴侣已成为国际上的前沿课题。葡 萄糖调节蛋白(glucose regulated proteins, GRPs)是内质网中一类重要的驻 留蛋白,包括GRP78和GRP94。GRP94是热休克蛋白HSP90家族的成员 之一,与HSP90具有50%的同源性,是高度保守的蛋白。grp94的遗传学定 位清楚,编码基因位于染色体12q24.2-12q 24.3。目前已知GRP94的功 能主要是作为分子伴侣,在新生肽链合成的早期阶段,与新生肽键形成稳定 的复合物,参与蛋白质的折叠、装配和转运。此外发现它还具有抗原提呈作 用,在正常细胞中参与折叠错误蛋白到蛋白酶体的提呈;在肿瘤细胞中作为 主要的肿瘤排斥抗原,引发针对该肿瘤细胞的特异性免疫反应。近年来研 究认为GRP94还可能与细胞周期、细胞分化和凋亡存在一定的关系。由于 肿瘤该认为是增殖失控、分化障碍最严重的细胞性疾病,因此研究GRP94 表达水平的变化对肿瘤细胞生物学特性的影响,可以迸一步丰富对GRP94 功能的认识。 GRP94作为应激蛋白,其转录水平在许多生理和病理条件下都可明显 升高,与此相关的从内质网到细胞核的信号传导通路就是未折叠蛋白反应 (the unfolded protein response,UPR)通路。哺乳动物细胞的UPR通路涉及 与折叠能力相关的一系列基因转录上调、蛋白质普启蒙翻译下降、GHOP介导 的程序性死亡及内质网相关性蛋白降解等多个分支。这些分支虽有一定的 自主性,但却存在着千丝万缕的联系,因此其中某个支路上效应成分的改 变,就可能会对整个UPR通路产生影响,甚至影响细胞的命运。研究 GRP94表达水平的变化对UPR各支路的影响,不仅有助于认识GRP94的 功能,还有助于理解UPR通路的变化。 基于此,我们选择了人大肠癌细胞株CCL229作为研究对象,通过特异 性核酶打靶的方式,下调细胞中GRP94的表达水平,观察其对人大肠癌细 胞某些生物学特性及UPR通路的影响,加深对GRP94、UPR和肿瘤这三者 间关系的了解。 方法 1.稳定下调GRP94的人大肠癌细胞克隆株的构建 (1)分别对含有特异性打靶GRP94核酶的质粒pRc/RSV-ribo1和对 照组质粒pRc/RSV进行小量提取、PvuⅡ酶切鉴定。 (2)测定pRc/RSV-ribo1和pRc/RSV的基因序列,以质粒DNA大量 提纯方法获得纯化的质粒。 (3)按照Fugene TM 6 transfection reagent说明书分别用两种质粒转染人 大肠癌细胞CCL229。 (4)分别通过RT-PCR方法和Western blot方法从mRNA和蛋白水平 检测GRP94的表达情况,以此鉴定转染成功的阳性克隆株。 2.检测GRP94表达水平下降对人大肠癌细胞生物学特性的影响 (1)光镜下观察纲胞的形态、贴壁状态、聚集生长能力和生长速度。 (2)绘制细胞生长曲线,计算细胞群体倍增时间。 (3)检测细胞聚集能力,计算细胞的聚集度。 (4)流式细胞仪检测细胞周期分布。 3.检测GRP94表达水平下降对相关分子伴侣GRP78和PDI的影响 (1)分别通过RT-PCR方法和Western blot方法从mRNA和蛋白水平 检测分子伴侣GRP78的表达情况。 (2)分别通过RT-PCR方法和Western blot方法从mRNA和蛋白水平 检测折叠酶PDI的表达情况。 4.检测GRP94表达水平下降对UPR中CHOP通路的影响 (1)利用Western blot和兔疫细胞化学方法检测UPR通路特异的,与程 序性死亡密切相关的CHOP蛋白表达水平。 5.检测稳定下调GRP94羡达水平的细胞株对化疗药物的敏感性 (1)利用荧光显微镜和透射电子显微镜从形态学角度观察核酶转染细 胞和对照组纫胞在不同浓度的顺铂作用下凋亡的迸程。 (2)利用DNA琼脂糖凝胶电泳方法分析纫胞对药物的敏感性。 (3)利用Western blot检测caspase-3活性片段。 (4)MTT法检测细胞生长抑制率。 (5)流式细胞仪检测DNA含量的变化。 结果 1.获得了5个稳定表达GRP94核酶的克隆株 pRc/RSV-ribo1质粒转染人大肠癌细胞CCL229后,以G418筛选出 39个抗性克隆,24孔板培养10天后,25个克隆逐渐死亡。移入小培养瓶 生长后,又有5个克隆由于贴壁生长能力差而死亡,只有9个克隆存活下 来。应用RT-PCR和Western blot方法发现5个抗性细胞克隆在A23187 (5μM)作用16h后,GRP94的表达水平比相同状态下的对照组细胞明显降 低,鉴定力阳性克隆。选取其中一株(CCL229T7)进行后续实验。转染空载 体pRc/RSV的细胞命名为CCL229C。应激诱导后的细胞以“+A”表示。 2.稳定下调GRP94的细胞克隆株的生物学特性变化 光镜观察未发现细胞形态有明显改变,但可见细胞生长缓慢,传代过程 中不易贴壁及细胞密集性生长能力较差的现象。细胞生长曲线显示 GRP94表达水平下降的细胞株增殖能力明显降低,在应激状态下甚至出现 了负增长。细胞聚集能力检测发现在应


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