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1.喉癌相关新基因MTLC的克隆及特性分析  2.hTERT cDNA片段的克隆、表达、单抗制备及应用研究

邱广斌  
【摘要】: 喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell cancer,LSCC)是东北地区高发的肿瘤,其病因不明,探讨喉癌发生的分子机制是进行有效的临床诊治的基础。喉癌的遗传学研究资料有限,大多为已知单个基因的突变和表达研究,如ras、c-Myc、EFGR、PRAD、Int-2等癌基因和p53、Rb、p16、FHIT等抑癌基因与喉癌相关性的报道,迄今尚未发现喉癌相关基因克隆的报道。因此,开展喉癌相关基因的分离、克隆及定位研究无疑是一个重要课题。 随着人类基因组测序及生物信息学的快速发展,产生了大量可供利用的基因组信息和分析软件。充分利用这些数据和工具来寻找新基因,了解基因的功能及其与人类疾病的关系,是功能基因组学研究的主要任务,也是目前基因克隆的主要策略之一。 本实验室在前期喉癌组织原代培养和杂合性丢失(loss of heterozygosity,LOH)研究中发现,染色体6q25区域存在高频率的缺失,但目前没有该区域中存在喉癌相关基因的报道。我们在此基础上,采用以表达序列标签(expressed sequence tag,EST)为电子探针,在人类基因组数据库中进行电子杂交,钓出相应的基因组序列并预测新基因的方法,大规模筛选喉癌相关新基因。本研究运用这一策略首次成功克隆到一个新基因,并对其生物学特性作了初步分析。 材料与方法 1 材料与试剂 喉癌组织及癌旁组织取自解放军463医院耳鼻喉科手术切除标本; TRIZOL Reagent、Taq DNA聚合酶购自GibcoBRL公司; 反转录试剂盒、DNA纯化试剂盒购自Promega公司; pEGFP-C3载体、Lipofectamin2000脂质体转染试剂盒购自Invitrogen 当前计算机克隆新基因大多采取EST拼接策略,通过对EST数据库中的序 列进行分类、整合、组装,直接获得大片段或全长cDNA序列。从这种途径 克隆得到的新基因一般是已知基因的同源基因,不能直接了解其与疾病发 生的关系。本研究在细胞遗传学研究的基础上,借用EsT数据库和人类基 因组数据库的信息预测相关染色体区域的新基因,直接筛选疾病相关新基 因,是一种有效的候选定位克隆的新策略。通过这种方法,我们成功克隆了 一个喉癌相关新基因,将其命名为MTLC(c一Myc target伽ml呵nge滋canc- er eells)。 Northem blot分析表明MTLC基因在多种组织中有表达,提示该基因可 能对维持细胞的正常生理功能是必需的。对MTLC基因启动子区的分析显 示其中存在两个c一Myc结合位点,表明它可能是。一Myc的一个靶基因。 。一Myc作为转录因子的功能非常广泛,现有研究表明其下游靶基因参与细 胞转化、分化、凋亡和细胞周期调控,还可促进细胞生长和血管生成,并可诱 导基因组不稳定。对MTLC基因编码蛋白的氨基酸序列分析表明其中只存 在一个核定位信号结构域,亚细胞定位实验也表明该基因在细胞核表达,这 提示MTLC基因可能作为C一Myc的一个下游基因以转录因子的形式在细 胞信号传导通路中发挥重要作用。 RT一PCR研究表明MTLC基因在喉癌组织中表达下调;而细胞转染实 验证实MTLC过表达可抑制喉癌He哗细胞生长并促进其凋亡,这些结果表 明MTLC基因可能对喉癌的发生有重要的作用。本研究为进一步了解 MTLC基因的功能及其在细胞信号传导通路中的位置打下了良好的基础。 结论 1首次应用生物信息学手段克隆了一个喉癌相关新基因,命名为 MTLC,GenBank登录号AF527367。该基因位于6够5 .2,全长约Zlkb,eDNA 长1 006bp,编码235个氨基酸。 2 MTLC基因在多种组织中有表达,其中肝脏中表达最高。亚细胞定位 实验表明MTLC基因主要在细胞核表达。 3 MTLC基因在喉癌组织中表达下调,并可抑制喉癌细胞系He衅细胞 生长、促进凋亡,提示MTLC可能与喉癌形成有关。


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