收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

氟化物对骨形成中成骨细胞影响的实验研究

张颖  
【摘要】: 目的 我国是地方性氟中毒发生率较高的大国,由于氟的过量摄入导致的氟骨症困扰了许多患者。目前人们对于氟的骨相损伤机制尚不完全清楚。成骨细胞作为骨组织中重要的功能细胞,在骨的形成过程中起着关键作用。 本研究目的在于建立体外大鼠(乳鼠)颅骨成骨细胞分离培养体系及鉴定技术,排除体内多种调控因素的相互影响,从单细胞的形态和代谢指标的变化,观察氟化物对体外培养的成骨细胞的直接效应,探讨不同浓度氟化物对成骨细胞是否具有促进增殖和分化作用,从而在细胞水平了解氟化物对骨形成过程的作用;通过体内、外实验研究氟化物对成骨细胞结构、细胞周期和细胞凋亡的影响,为进一步探讨氟致骨骼损伤的机制提供基础资料;通过检测氟化物对成骨细胞的DNA损伤,探讨成骨细胞对氟化物的基因毒性反应,为全面评价氟毒性提供科学依据。 方法 1.大鼠颅骨成骨细胞分离培养纯化体系及鉴定技术的建立: 生后2天的Wistar乳鼠脱颈处死后,无菌取颅盖骨放入盛有缓冲液的培养皿中,尽量去除骨膜和周围结缔组织。加入0.25%胰蛋白酶液,37℃恒温消化20min。再用1mg/mlⅡ型胶原酶溶液,37℃恒温消化90min,使细胞从骨基质中解离出来。将上述含分离细胞及骨片的消化液移于离心管中离心,去上清,加入含15%胎牛血清的199培养液,反复吹打成单细胞悬液,以1×10~5/ml加入培养瓶,置于37℃、5%CO_2培养箱中培养,隔天换液。应用差速黏附法纯化成骨细胞。Ⅰ型胶原免疫组化方法鉴定成骨细胞。 2.成骨细胞增殖、分化指标的测定 成骨细胞以5×10~4/ml接种至96孔板,24小时后换为无血清199培养液,次日加入不同浓度(0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、4mmol/L)的氟化钠继续培养24、48、72h,采用AlamarBlue摄入法检测细胞增殖;Elisa方法测定碱 性磷酸酶活性。 3.成骨细胞周期和细胞凋亡的检测 成骨细胞以 IX 10VInl接种至 25Inl培养瓶,在含 15%胎牛血清的 199 培养液中培养 3天。换为无血清 199培养液,24小时后加人终浓度为门。 1上J/。OU)的氟化钠,继续培养24 /J’时。用0.25%胰酶消化各组细 胞,PBS洗2次,加人配制好的PI染液37℃孵育30分钟,用流式细胞仪检 测细胞周期和细胞凋亡。 4.细胞 DNA损伤检测 成骨细胞以 IX 10Vd接种于 6孔板,待细胞融合后,换为无血清 199 培养液中培养 24 /J’时。加人终浓度为 0刀.5上在* rnmol/L氟化钠作用 24 /J’时。经胰蛋白酶消化,离心弃上清,PBS冲洗2次,计数并调整使各剂量 组细胞悬液中细胞数为 1.0 X 10VInl。用单细胞凝胶电泳(营星实验)方法 检测DNA损伤。 5.动物实验 雌性 Wistar大鼠 40只随机分成 4组止组门照组)大鼠饲正常饲料, 饮蒸馏水出组饮用蒸馏水含氟化钠 50mg/L;C组饮用蒸馏水含氟化钠 100m矿L山组饮用蒸馏水含氟化钠150m吵L。大鼠自由进食水,60天后全 部雌鼠与20只雄鼠按2:二进行交配。所生仔鼠颅盖骨进行光镜、电镜观 察;提取仔鼠颅骨成骨细胞,观察细胞超微结构,检测细胞周期与细胞凋亡 的变化。 6.数据处理 用 EXCEL3.0进行实验数据的统计分析。 结 果 1.原代成骨细胞培养结果: 门)相差显微镜观察 分离的成骨细胞在培养24h后,活细胞贴壁生长。贴壁生长的细胞呈 梭形、三角形或多角形等。成骨细胞在单层铺满培养瓶后可出现重叠生长, 其中心部细胞密集并可发生钙化,形成肉眼可见的散在白色点状物。 p)I型胶原免疫组化鉴定 ·2· 成骨细胞的胞浆内和细胞间质中分布有棕黄色颗粒,为成骨细胞所分 泌的1型胶原,胞核空染,为阳性结果。 2.不同浓度的氟化钠对成骨细胞增殖、分化的影响 低浓度氟化钠 (100umoU-lmmoULL 72h在体外可刺激细胞增殖; 高浓度氟化钠门 以上)可抑制细胞增殖;NaF浓度10PmoUL- 50pmoUL,4d增强细胞 ALP活力;100pmoUL Li上的 NaF降低了细胞 ALP 活力。 3.不同浓度的氟化钠对体外培养成骨细胞细胞周期和细胞凋亡的影响 NaF浓度为0-ZmmoUL在4h对体外培养成骨细胞活性无影响。浓度 Zmmol/L时S期细胞数增多,G/Gl期和G/M期细胞无明显改变。NaF 浓度为3户nunoUL时,抑制了细胞的活性/期细胞数明显增多,G/M期细 胞明显减少。NaF浓度为23Anunol/L时,凋亡百分率增高。 4.不同浓度的氟化钠对体外培养成骨细胞DNA的损伤作用 在相同的条件下,用 0-3。oVL的陇F作用于 OB,发现地F可不同 程度的诱导 DNA链断裂。与对照组相比,0.5-InunoUL组 DNA迁移距离 (尾长)虽有所增加,但差别没有显著性。2-3 nunoUL组 DNA迁移距离 (尾长片对照组明显增加,差异显著。3nunol/L组营星尾长与ZmmoUL组 相比也有显著性差异。 5.母鼠体内不同程度染氟对所生仔鼠颅骨成骨细胞的影响 5.l母鼠染氟对所生仔鼠颅骨成骨细胞的超微结构的影响 对照组可见


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 张颖,孙贵范,金亚平,王毅;氟化物对大鼠成骨细胞增殖分化的影响[J];中国公共卫生;2003年04期
2 徐辉;井玲;李相军;李广生;;GSH/GSSG在染氟成骨细胞中的变化[J];中国地方病防治杂志;2008年02期
3 刘晓秋,孙波,李广生;氟对成骨细胞的作用[J];中国地方病防治杂志;2000年03期
4 张颖,梁英杰,郭晓英,李昕,孙鲜策,孙贵范,王路;母鼠高氟摄入对仔鼠颅骨成骨细胞的影响[J];卫生研究;2005年01期
5 李丹;李艳辉;范哲;李广生;;氟对大鼠成骨细胞Ⅰ型胶原表达的影响[J];中国地方病学杂志;2006年02期
6 钟苑芳;钟炜轲;陈秉;贺凌飞;戴文涛;王军义;余日安;;氟对大鼠成骨细胞氧化应激和8-羟基脱氧鸟苷生成影响[J];中国职业医学;2011年02期
7 王军舰;王海彬;;氟对人成骨样细胞株凋亡的影响[J];中国公共卫生;2005年12期
8 富昭,刘军;氟化物对成骨细胞的作用[J];国外医学.医学地理分册;1998年04期
9 张颖,孙贵范,金亚平,贾丽红,王毅;氟对成骨细胞增殖分化的影响及维生素C的拮抗作用[J];中华劳动卫生职业病杂志;2003年04期
10 郭昭庆,党耕町,王志国;氟化钠及续断组分对成骨细胞增殖的影响[J];中华骨科杂志;1998年02期
11 邓力,蒋学华,赵语;氟化钠缓释片对成骨细胞的存活和增殖能力的影响[J];中国口腔种植学杂志;1999年02期
12 刘岳强;刘开泰;杨晓燕;刘继文;钟近洁;周婷婷;;氟对体外培养的成骨细胞Ras蛋白表达的影响[J];新疆医科大学学报;2008年08期
13 郭晓英;蔡偌欣;何杨;吴思思;孙贵范;;氟对MC3T3-E1细胞矿化能力的影响[J];环境与健康杂志;2010年08期
14 桂传枝,王长松,于燕妮,唐俊杰,刘家骝;氟对软骨细胞与成骨细胞凋亡及H_2O_2、SOD、NO的影响[J];中国地方病学杂志;2004年02期
15 华坤,计国义,李广生;氟化物对成骨细胞OPGL mRNA和M-CSF mRNA表达的影响[J];中国地方病学杂志;2003年02期
16 张亚楼;刘开泰;;氟化钠诱导成骨细胞内质网应激特征[J];环境与健康杂志;2010年03期
17 张亚楼;刘开泰;刘继文;钟近洁;;氟对saos-2细胞体外增殖的影响[J];中华疾病控制杂志;2010年06期
18 张文岚,崔亚南,高申,张秀云,李广生;过量摄入氟后激活的成骨细胞系中原癌基因的表达[J];中华预防医学杂志;2003年04期
19 F.Raue,R.Ziegler,胡蜀红;骨代谢和骨病[J];The Chinese-German Journal of Clinical Oncology;1997年03期
20 余达林,崔舜;氟化钠对成骨细胞增殖及分化影响的实验研究[J];同济医科大学学报;2000年05期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王梅;吴培福;赵德明;苏敬良;韩博;;氟对体外培养成骨细胞骨钙素基因表达的影响[A];中国畜牧兽医学会2006学术年会论文集(下册)[C];2006年
2 钟苑芳;贺凌飞;夏源;钟炜轲;戴文涛;陈秉;王军义;余日安;;氟对大鼠成骨细胞抗氧化酶HO-1及Nrf2mRNA表达的影响[A];广东省环境诱变剂学会、广东省预防医学会卫生毒理专业委员会2010年学术会议资料汇编[C];2010年
3 祝振华;;缺锌对生长期大鼠长骨成骨细胞维生素D受体及钙结合蛋白基因表达的影响[A];中华医学会第八次全国小儿外科学术会论文集[C];2010年
4 邹海滨;苏宜香;;大豆异黄酮类对体外培养大鼠成骨细胞的影响[A];中国营养学会第五届妇幼营养学术会议论文摘要汇编[C];2002年
5 杨茗;傅风华;张树平;;菝葜皂苷元对成骨细胞活性的影响[A];2008年全国抗衰老与老年痴呆学术会议论文集[C];2008年
6 全仁夫;杨迪生;苗旭东;李伟;吴晓春;汪宏斌;;二氧化锆梯度复合羟基磷灰石生物材料对大鼠成骨细胞体外活性的影响[A];2008年浙江省骨科学学术年会论文汇编[C];2008年
7 刘琴丽;孙树津;霍波;龙勉;;成骨细胞铺展形状和面积对其凋亡的影响[A];第九届全国生物力学学术会议论文汇编[C];2009年
8 顾琪;张学军;贺恒益;朱汉民;;体外培养大鼠颅骨成骨细胞生物学特性的初步研究[A];中国细胞生物学学会第七次会议论文摘要汇编[C];1999年
9 胡金家;王曼莹;;含药血清的制备及其对成骨细胞代谢的影响[A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集[C];2001年
10 任高宏;林昂如;裴国献;胡罢生;;高分子量聚乙烯对成骨细胞活性及新骨形成的影响[A];中国康复医学会修复重建外科专业委员会第十四次全国学术交流会论文集[C];2004年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 张颖;氟化物对骨形成中成骨细胞影响的实验研究[D];中国医科大学;2003年
2 钟近洁;氟对成骨细胞增殖及其MCM3基因表达的影响[D];新疆医科大学;2006年
3 吕红兵;颅神经嵴细胞的培养特性及向神经细胞、成骨细胞的定向诱导分化[D];第四军医大学;2002年
4 谭晓红;成骨细胞特异性Smad4基因剔除导致小鼠早期发生骨质疏松[D];中国人民解放军军事医学科学院;2004年
5 曹强;以藻酸钙为载体的可注射性组织工程骨研究[D];中国人民解放军第四军医大学;2003年
6 李良;力学刺激对绝经后骨质疏松大鼠成骨细胞作用的细胞分子基础[D];四川大学;2004年
7 罗晓中;组织工程骨低温保存的实验研究[D];四川大学;2005年
8 丁仲鹃;种植体表面微形态对骨形成影响的研究[D];四川大学;2004年
9 刘颖;应力刺激下成骨细胞c-fos基因表达及影响因素的实验研究[D];四川大学;2004年
10 仇丽鸿;静磁场对大鼠成骨细胞及其牙周炎组织影响的研究[D];中国医科大学;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 刘岳强;氟对体外培养的成骨细胞中Ras基因表达的影响[D];新疆医科大学;2007年
2 金钫;MMPs在大鼠牙周组织改建以及体外培养成骨细胞中的表达[D];第四军医大学;2001年
3 郦光丰;骨组织力电效应及成骨细胞离体培养的数值分析[D];重庆大学;2002年
4 任高宏;成人骨髓基质干细胞体外培养及体内成骨的实验研究[D];中国人民解放军第一军医大学;2003年
5 周红星;兔活骨组织体外促同种成骨细胞与支架粘附的实验研究[D];第三军医大学;2003年
6 邬霞;成骨细胞玻璃化冷冻保护剂的研究[D];大连理工大学;2004年
7 赵宏艳;左归丸对破骨细胞骨吸收功能的影响以及成骨细胞的介导作用[D];中国中医研究院;2005年
8 梁衍涛;接骨散对家兔自体骨移植修复骨缺损的实验研究[D];黑龙江中医药大学;2005年
9 章永江;兔骨髓间充质干细胞生物学特性和自体皮下移植的成骨研究[D];天津医科大学;2005年
10 唐井钢;补肾中药血清对破骨细胞的生物学作用及OPG/OPGL与破骨细胞活性的相关性研究[D];第一军医大学;2005年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 钱铮;日本利用人类胎盘培育出成骨细胞[N];中国劳动保障报;2006年
2 钱铮;日本利用人类胎盘培育出成骨细胞[N];医药经济报;2006年
3 杨丽佳通讯员 周宁人;骨折不愈合缘于成骨细胞“爬不动”[N];健康报;2008年
4 杨丽佳周宁人;骨折不愈合 缘于成骨细胞“爬不动”[N];大众卫生报;2008年
5 杨建辉;雌三醇对成骨细胞保护作用的研究[N];中国中医药报;2004年
6 本报记者 张林霞;一个氟化厂毁了一片完园[N];中国环境报;2000年
7 本报记者 陈建平;发挥萤石资源优势 做大做强氟化工业[N];郴州日报;2009年
8 张永闻 施黎明;巨化氟化公司完成排污管网改造[N];中国化工报;2010年
9 香港麦迪信医学出版有限公司供稿;多因素影响骨代谢平衡[N];医药经济报;2003年
10 王婷 张金超 杨梦甦 肖培根;颇具潜力的抗骨质疏松症中药[N];中国医药报;2006年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978