蚊体内疟原虫雄配子体出丝机制的研究

【摘要】： 疟原虫是在脊椎动物和媒介昆虫蚊之间循环传播的，配子体是连接两者使其完成生活史的唯一发育阶段，而雄配子体在蚊胃腔内的出丝现象则是疟原虫经蚊传播的重要环节。已有报道表明，环境温度降低和pH升高(从哺乳动物血液pH升至8.0)诱导体外雄配子发生。然而，蚊吸血后其胃内容物的pH并未超过7.8，即体外诱导雄配子体出丝的临界pH值，因此必有其它因素存在于吸血后的蚊胃内容物中诱导雄配子发生。已有学者分别从斯氏按蚊(Anopheles stephensi)蛹和成虫头部纯化出这种配子发生激活因子(gametocyte activating factor，GAF)，并鉴定其化学成分为黄尿酸(xanthurenic acid，XA)。XA是色氨酸分解代谢旁路产物之一，主要分布于昆虫成虫的头、眼部，其存在与昆虫眼及翅的颜色形成有关。 为探索蚊体内GAF的作用机制，本实验以“按蚊唾液腺内含有GAF，吸血时与唾液、血液一同返流至胃腔，并诱导雄配子发生”为命题，进行了以下研究：(1)应用体外雄配子体出丝观察及其它相关方法，首次对斯氏按蚊唾液腺抽提物和匀浆上清中的GAF进行了分析，以期阐明按蚊唾液腺GAF在哺乳动物疟原虫传播过程中的作用机制；(2)对斯氏按蚊、大森按蚊(An.omorii)、中华按蚊(An.sinensis)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)、白纹伊蚊(Ae.albopictus)和淡色库蚊(Culex pipiens pallens)等3属6种蚊唾液腺抽提物的GAF活性及其中5个蚊种雌蚊唾液腺抽提物GAF活性在吸血前后的变化进行了比较分析，以期阐明按蚊属媒介昆虫在哺乳动物疟疾传播中的作用；(3)选取羽化后不同蚊龄、吸血前后不同蚊龄、产卵前后不同蚊龄的雌性斯氏按蚊唾液腺和卵巢为模型器官，对2种器官中GAF和总蛋白含量的动态变化进行了分析，以期阐明按蚊唾液腺中GAF的活性动态与蚊卵产出的关系。 材料和方法 实验动物 1．啮齿动物疟原虫：柏氏疟原虫由日本自治医科大学医动物学教室 经BALB／c小鼠和斯氏按蚊循环保种。冻存复苏的柏氏疟原虫经腹腔接种 BALB止 ／J＼鼠，感染后第 10～12天采小鼠尾静脉血用于雄配子体出丝观 察。 2．媒介昆虫：斯氏按蚊、大森按蚊、埃及伊蚊、白纹伊蚊和淡色库 蚊均由日本自治医科大学医动物学教室保存并传代饲养。中华按蚊幼虫 采自日本杨木县河内郡南河内叮自治医科大学周边地区，由同实验室饲 养至成虫。 3．小鼠：雌性 BALB业和 ICR小鼠购于日本 SLC公司。 主要试剂及仪器设备 由日本自治医科大学医动物学教室提供。 实验方法 1．雌蚊吸血实验 吸血前6h停止喂饲果糖溶液，吸食小鼠血液30～60min，留取血食 充分的蚊继续饲养，根据实验所需收集吸血前后不同蚊种各时相点唾液 腺及其它相关器官。 2．唾液腺收集及抽提物制备 首先将不同种蚊置于《0℃冷冻麻痹，在立体解剖显微镜下解剖蚊体， 将完整的唾液腺洗涤后立即置入含有 100HI培养液的 Eppendorf管中，再 次离心洗涤后奔除上清，将含有唾液腺沉淀的离心管置于二0℃和室温冻 融各3次，最后将抽提物置于上0℃保存。 3．斯氏按蚊头、唾液腺及卵巢匀浆上清制备 按上述方法解剖按蚊，收集蚊头、唾液腺和卵巢。将完整的头、唾液 腺及卵巢立即分别置入含有 100pl RPMI 1640（PH 7．二）的 Eppendorf管中， 冷冻并在冰浴上制成匀浆后 5000 pm离心 smin，弃除沉淀，最后将上清 置于上0 OC保存。 4．体外雄配于体出丝观察 所有实验过程均在 ZI oC条件下进行。实验前按实验所需浓度以 RPMI －2－ 1640稀释待测样品至工作浓度，抽取 0．spl柏氏疟原虫感染的 BALB／C ’J’鼠尾尖血液，在双孔亲水玻片上与 5 pl样品溶液混合，加盖片孵化 15min，光学显微镜下观察出丝运动中心，10x40倍率记数 10个视野， 每组样品至少重复 3次实验，以 RPMll 640，pH 8对条件下所获出丝运动 中心数的百分率均数土标准误表示GAF活性。 5．斯氏按蚊头、唾液腺及卵巢总蛋白含量测定 按前述方法收集蚊头、唾液腺和卵巢，分别置入含有 100VI PBS的 Eppendorf管中，制成匀浆并稀释成工作浓度。蛋白测定在96孔酶标板上 进行，每孔反应体积为 200…，ELISA检测仪测量 595urn OD值，根据标 准曲线计算总蛋白含量。 6．斯氏按蚊分组 （1）未吸血组：分另于羽化后当天，第 2、4、6、8。10。12和 I4 天解剖蚊体；Q）吸血后未产卵组：羽化后第6天吸食小鼠血，留取血 食充分的按蚊继续饲养。分别于吸血前当天、吸血后lh内、吸血后第2、 4、6和8天解剖蚊体；臼）吸血后产卵组：按吸血后未产卵组处理方法 让按蚊吸血，吸血后第3天允许按蚊产卵。吸血后第4天（产卵翌日） 至第8天，检查按蚊产卵情况，选用己完成产卵的按蚊，与未产卵组相 同各时相点解剖蚊体。 7．聚丙烯酸胺凝胶电泳分析 按前述方法在各时相点分别收集按蚊唾液腺。将样品置于PBSu对 唾液腺八0…PBS人上0℃保存。实验前于室温融解唾液腺样品，加匕… 样品缓冲液混?