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蚊体内疟原虫雄配子体出丝机制的研究

王继春  
【摘要】: 疟原虫是在脊椎动物和媒介昆虫蚊之间循环传播的,配子体是连接两者使其完成生活史的唯一发育阶段,而雄配子体在蚊胃腔内的出丝现象则是疟原虫经蚊传播的重要环节。已有报道表明,环境温度降低和pH升高(从哺乳动物血液pH升至8.0)诱导体外雄配子发生。然而,蚊吸血后其胃内容物的pH并未超过7.8,即体外诱导雄配子体出丝的临界pH值,因此必有其它因素存在于吸血后的蚊胃内容物中诱导雄配子发生。已有学者分别从斯氏按蚊(Anopheles stephensi)蛹和成虫头部纯化出这种配子发生激活因子(gametocyte activating factor,GAF),并鉴定其化学成分为黄尿酸(xanthurenic acid,XA)。XA是色氨酸分解代谢旁路产物之一,主要分布于昆虫成虫的头、眼部,其存在与昆虫眼及翅的颜色形成有关。 为探索蚊体内GAF的作用机制,本实验以“按蚊唾液腺内含有GAF,吸血时与唾液、血液一同返流至胃腔,并诱导雄配子发生”为命题,进行了以下研究:(1)应用体外雄配子体出丝观察及其它相关方法,首次对斯氏按蚊唾液腺抽提物和匀浆上清中的GAF进行了分析,以期阐明按蚊唾液腺GAF在哺乳动物疟原虫传播过程中的作用机制;(2)对斯氏按蚊、大森按蚊(An.omorii)、中华按蚊(An.sinensis)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)、白纹伊蚊(Ae.albopictus)和淡色库蚊(Culex pipiens pallens)等3属6种蚊唾液腺抽提物的GAF活性及其中5个蚊种雌蚊唾液腺抽提物GAF活性在吸血前后的变化进行了比较分析,以期阐明按蚊属媒介昆虫在哺乳动物疟疾传播中的作用;(3)选取羽化后不同蚊龄、吸血前后不同蚊龄、产卵前后不同蚊龄的雌性斯氏按蚊唾液腺和卵巢为模型器官,对2种器官中GAF和总蛋白含量的动态变化进行了分析,以期阐明按蚊唾液腺中GAF的活性动态与蚊卵产出的关系。 材料和方法 实验动物 1.啮齿动物疟原虫:柏氏疟原虫由日本自治医科大学医动物学教室 经BALB/c小鼠和斯氏按蚊循环保种。冻存复苏的柏氏疟原虫经腹腔接种 BALB止 /J\鼠,感染后第 10~12天采小鼠尾静脉血用于雄配子体出丝观 察。 2.媒介昆虫:斯氏按蚊、大森按蚊、埃及伊蚊、白纹伊蚊和淡色库 蚊均由日本自治医科大学医动物学教室保存并传代饲养。中华按蚊幼虫 采自日本杨木县河内郡南河内叮自治医科大学周边地区,由同实验室饲 养至成虫。 3.小鼠:雌性 BALB业和 ICR小鼠购于日本 SLC公司。 主要试剂及仪器设备 由日本自治医科大学医动物学教室提供。 实验方法 1.雌蚊吸血实验 吸血前6h停止喂饲果糖溶液,吸食小鼠血液30~60min,留取血食 充分的蚊继续饲养,根据实验所需收集吸血前后不同蚊种各时相点唾液 腺及其它相关器官。 2.唾液腺收集及抽提物制备 首先将不同种蚊置于《0℃冷冻麻痹,在立体解剖显微镜下解剖蚊体, 将完整的唾液腺洗涤后立即置入含有 100HI培养液的 Eppendorf管中,再 次离心洗涤后奔除上清,将含有唾液腺沉淀的离心管置于二0℃和室温冻 融各3次,最后将抽提物置于上0℃保存。 3.斯氏按蚊头、唾液腺及卵巢匀浆上清制备 按上述方法解剖按蚊,收集蚊头、唾液腺和卵巢。将完整的头、唾液 腺及卵巢立即分别置入含有 100pl RPMI 1640(PH 7.二)的 Eppendorf管中, 冷冻并在冰浴上制成匀浆后 5000 pm离心 smin,弃除沉淀,最后将上清 置于上0 OC保存。 4.体外雄配于体出丝观察 所有实验过程均在 ZI oC条件下进行。实验前按实验所需浓度以 RPMI -2- 1640稀释待测样品至工作浓度,抽取 0.spl柏氏疟原虫感染的 BALB/C ’J’鼠尾尖血液,在双孔亲水玻片上与 5 pl样品溶液混合,加盖片孵化 15min,光学显微镜下观察出丝运动中心,10x40倍率记数 10个视野, 每组样品至少重复 3次实验,以 RPMll 640,pH 8对条件下所获出丝运动 中心数的百分率均数土标准误表示GAF活性。 5.斯氏按蚊头、唾液腺及卵巢总蛋白含量测定 按前述方法收集蚊头、唾液腺和卵巢,分别置入含有 100VI PBS的 Eppendorf管中,制成匀浆并稀释成工作浓度。蛋白测定在96孔酶标板上 进行,每孔反应体积为 200…,ELISA检测仪测量 595urn OD值,根据标 准曲线计算总蛋白含量。 6.斯氏按蚊分组 (1)未吸血组:分另于羽化后当天,第 2、4、6、8。10。12和 I4 天解剖蚊体;Q)吸血后未产卵组:羽化后第6天吸食小鼠血,留取血 食充分的按蚊继续饲养。分别于吸血前当天、吸血后lh内、吸血后第2、 4、6和8天解剖蚊体;臼)吸血后产卵组:按吸血后未产卵组处理方法 让按蚊吸血,吸血后第3天允许按蚊产卵。吸血后第4天(产卵翌日) 至第8天,检查按蚊产卵情况,选用己完成产卵的按蚊,与未产卵组相 同各时相点解剖蚊体。 7.聚丙烯酸胺凝胶电泳分析 按前述方法在各时相点分别收集按蚊唾液腺。将样品置于PBSu对 唾液腺八0…PBS人上0℃保存。实验前于室温融解唾液腺样品,加匕… 样品缓冲液混?


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