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新生大鼠HIBD晚期神经细胞凋亡及bFGF对其影响

王菊莉  
【摘要】: 目的 新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)可致新生儿死亡或永久性的神经系统损伤,现已证明,新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后存在神经细胞凋亡,主要位于实验侧皮层、海马、丘脑及纹状体。Caspase家族,是近年来新发现的一类天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶,哺乳类启今已发现至少14种Caspases参与细胞凋亡。Capase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶,一旦被激活,凋亡常难以避免,因此Caspase-3是有可能被阻抑的最下游凋亡执行蛋白,该酶是否被激活也是鉴别细胞凋亡与坏死的主要依据。Caspase-3与ced-3高度同源,是细胞在执行PCD过程中的关键步骤。已证明,大脑缺血后表达、裂解并活化了Caspase-3。大量研究已证明,新生大鼠HIBD后Caspase-3活化参与了神经细胞凋亡。HI后连续表达活化的Caspase-3和凋亡性形态的细胞持续存在达数天提示在新生儿缺氧缺血性脑损伤中凋亡持续存在。Bel-xL是Bel-2家族成员之一,具有抗凋亡作用,Bel-xL表达增加可阻止Caspase-3活化,从而阻止凋亡的级联反应。 本文研究新生大鼠缺氧缺血性脑损伤神经细胞凋亡持续时程,新生大鼠HIBD晚期Caspase-3、Bel-xL基因及其蛋白表达情况,以及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对HIBD晚期神经细胞凋亡的影响。方法 选用本院动物室提供的健康新生7日龄Wistar大鼠为研究对象,用Rice法制成HIBD模型。缺氧浓度为8±1%,舱温36±1℃,缺氧持续1.5 小时。本实验采用此模型进行以下实验。在缺氧缺血(HI)后不同时间处 死取脑进行研究,并设同批正常组及假手术组作对照,研究内容如下:1.应 用苏木素一伊红(HE)染色、透射电镜、流式细胞检测术(FcM)及末端脱氧 核昔酸转移酶(TdT)介导的生物素化一dUTP原位缺口末端标记(TUNEL) 研究新生大鼠扭BD晚期神经细胞凋亡持续时程。2.应用逆转录聚合酶链 式反应(RT一PcR)及免疫组织化学方法研究与凋亡有关的基因CasPase一 3、Bd一xL的mRNA及其蛋白在新生大鼠Hl后晚期在脑中表达的情况。 RT一PcR:反转录合成cDNA第一链(RT),然后进行PCR扩增,用CIS- 700D凝胶扫描成像分析系统扫描各扩增产物,Casapse一3mRNA及Bd- xLmRNA表达水平以GApDH的相对表达量即Caspase一3/自廿DH及Bcl- xL/GAPDH计算,数据进行t检验。免疫组织化学方法:标本为脑组织石蜡 切片,预先经电炉加热抗原修复,进行SABC染色。结果判定:400倍光镜 下观察每组每个时间点各5只大鼠脑组织切片(各二张),经数码相机采 样,左右皮层及海马各5个视野,输人Meta Mp印h Imager勿stem versiou4.6, 将大脑皮层的免疫阳性细胞的染色强度变成量化指标,计算其平均光密度 (OD)值,两组间比较采用t检验。3.观察碱性成纤维细胞生长因子对新生 大鼠HIBD持续保护机制以及在新生大鼠HIBD晚期不同bFGF治疗方案 对CasPase一3和Bd一xL蛋白表达、DNA断裂的影响。首先制备新生大鼠 HIBD模型,随机分成6组:bFGFI组(HI后腹腔注射bFGF 4u·g一’,连用3 周)、bFGn组(HI后腹腔注射bFGF 4u·g一’,第一及第三周用)、bFG玲 组(111后腹腔注射bFGF 4u·g一’,仅第一周用)及相应治疗方案的生理盐 水对照组即对照1组、对照2组、对照3组,各组大鼠均于HI后3周处死, 每组各5只。比较TUNEL染色阳性细胞数及免疫组化方法观察CasPase- 3、Bcl一xL蛋白表达情况。 结果 1 .HE染色:HIBD动物模型组,在班后2周、3周、4周时左侧大脑后 扣带皮层区神经细胞明显少于右侧,额顶皮层运动区及额顶皮层躯体感觉、 区均可见神经细胞明显减少,皮层以111一W层细胞减少较I一n层明显,代 之以较多的星形胶质细胞;在HI后3周时即可见脑组织形成界限清楚的坏 死灶,坏死灶中可见较多的少突胶质细胞及小胶质细胞,半暗带内可见细胞 呈三种变性形态:①细胞皱缩、核浓缩;②胞浆内核碎片;③单个圆形凋亡小 体。有者在左侧丘脑处亦可见坏死灶。右侧扣带区皮质常为散在神经元丢 失、神经元排列紊乱等改变,正常组及假手术组均未见到明显的病变。 2.TUNEL染色结果:发现Hl后2周、3周和4周时在额顶皮层躯体感 觉区、纹状体、丘脑及海马处有一些散在的染色质浓缩呈黄色颗粒的圆形或 卵圆形的凋亡细胞,以额顶皮层躯体感觉区相对多见,在半暗带内亦可见凋 亡细胞,皮层以111一W层凋亡细胞较I一n层多。正常对照组全脑于各时 间点,10个高倍视野凋亡细胞数为O一6个(4.20土1 .30),可见大鼠于出生 后,在生理情况下大脑神经细胞发生极少量的凋亡,假手术组及右侧脑亦有 同样的规律。HI后3周时左脑凋亡细胞数为8.00土1.00,与正常组(4.20 土1 .30)比较,差异有显著性(t=5.17,P0.01);在Hl后4周时左脑凋亡 细胞数(4.00土1.00)与对照组比较差异无显著性(t=0.27,P0.05)。 3.局灶性脑缺血后脑组织DNA断裂百分率的变化:HI后3周时脑组 织DNA断裂百分率为8 .19土2.49,与正常组(3.04土0.12)比较,DNA断裂 百分率之间差异有显著性(t二4.62,P0.05),而HI后4周时则差异无显 著性(t=0.27,P0.05)。 4.透射电镜发现:HI后3周时,仍可见到凋亡细胞,表现为染色质边 集、聚集成块


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