内毒素致新生大鼠肺血管内皮细胞和基膜改变的特点与肺出血的关系

【摘要】： 前言 新生儿肺出血是新生儿期常见危重症之一，起病急，早期不易发现，自临床应用肺表面活性物质替代疗法以来，应用表面活性物质治疗后仍死亡的早产儿中，其肺出血，尤其是肺泡内出血的发生率仍较高。病死率高达40-50％。新生儿肺出血的病因很多，包括窒息，感染，动脉导管未闭，寒冷损伤，早产儿，多血症，血液凝固异常等。但其病理生理机制仍不清楚。临床研究结果显示，新生儿弥漫性肺出血患儿肺泡壁内的弹力纤维失去网状结构，血管基膜出现多处断裂；对肺出血新生儿监测肺动脉压力，发现肺出血死亡患儿左室收缩功能降低。目前新生儿肺出血的高发人群主要包括早产儿，极低出生体重儿，宫内发育迟缓(IUGR)患儿。并发现早产儿肺出血与早产儿动脉导管分流及肺内血流量增多有关。近年来的基础研究显示，肺部毛细血管压力衰竭是造成肺出血的原因之一。这种压力衰竭可发生于肺部毛细血管基膜成分(Ⅳ型胶原)缺乏时，其结果可导致高通透性肺水肿或大面积肺出血。这种压力衰竭的病理改变包括：肺毛细血管内皮细胞层，上皮细胞层，有时甚至毛细血管壁全层断裂。这种病理改变与新生儿肺出血的病理改变基本一致，并且，早产儿肺组织较新生儿肺组织发育不成熟，新生儿肺组织又较成年人肺组织发育不成熟，这种肺组织血管发育的差异可能是新生儿，尤其是早产儿易发生肺出血的原因之一。但是，必须要证明肺出血时存在肺血管的损伤，由于肺毛细血管存在内皮细胞和基膜的破坏，才使结构发育薄弱的新生儿肺组织在一些病因的作用下，易发生肺出血。 目前，用内毒素制备成年大鼠ARDS是已被公认的经典动物模型。感染也是新生儿发生肺出血的常见病因，但是，目前尚无研究新生儿肺出血发 病机制的动物模型。因此，我们尝试用经典的致成年大鼠All及ARDS的 LPS腹腔注射法来制备新生大鼠肺损伤和肺出血的动物模型，并与成年大 鼠对比，探讨内毒素损伤新生大鼠肺组织的病理特点及其发病机制。在成 人ARDS患者中，已有研究表明，成人弥漫性肺损伤存在肺血管基膜的损 伤，新生儿肺出血死亡患儿的病理也发现，肺毛细血管表现为基膜断裂。 以上研究结果表明，血管基膜在肺出血的发病机制中起着重要的作用。 所以，给新生大鼠腹腔注射内毒素，观察其不同时间点肺组织的病理改变， 尤其电镜下观察LPS作用后，肺毛细血管基膜是否发生断裂。血管基膜的 成分主要包括 IV型胶原和层粘连蛋白，采用 Western Blotting和原位杂交的 方法检测基膜的成分＊型胶原和层粘连蛋白的含量及其 mRNA在肺组织 的表达改变，并与成年大鼠对比，探讨新生大鼠易发生肺出血的原因。降解 w型胶原和层粘连蛋白的MMP系统中，采用免疫组化和RT－PCR的方法 检测 MMP－2及其抑制物 TIMP－2的蛋白及其 InRNA在肺组织表达的变 化。调节MMP系统表达改变的主要因素是纤溶酶，而纤溶酶是在t－PA的 作用下由纤溶酶原转变而来，所以，用RT－PCR的方法进一步研究t－PA 及其抑制物PAI则在肺组织中表达的改变，t－PA及其抑制物PAI一均 由血管内皮细胞所分泌，同时检测肺血管内皮细胞分泌PECAM一二的情 况，以证实肺血管内皮细胞在新生大鼠肺出血的发病机制中起着重要的作 用，并说明是由于拥损伤了肺血管内皮细胞，首先是内皮细胞的功能和 形态的改变，造成了基膜的损伤和局部的高凝状态，进而发生肺出血。以进 一步阐明e对新生大鼠肺组织的影响及其发病机制，为新生儿肺出血的 治疗提供依据。 实验材料与方法 一、动物模型 用LPS腹腔注射的方法制备新生大鼠动物（Wistar大鼠，日龄7天，体 重 12－189，共 88只）模型，剂量为 sing／km，致伤后大鼠随机活动。将新生 大鼠随机分为 8组，生理盐水对照组（A广 LPS注射后 30m组p入 lh组 （C），Zh组（D），4h组（E），sh组r）以上各组 n＝8，16h组＊组，n二 16）， 24h组出组，n＝24），其中 16h组＊）死亡 8只，24h组出）死亡 17只。所 ·2· 有存活动物按设定时间断头处死，立即打开胸腔，取右肺上叶留作提取 RNA用，右肺其余肺叶作光镜及电镜病理检查。成年大鼠随机分为7组， 对照组和LPS给药组，于相同时间点处死（无24小时组人每个时间点8 只。 二、标本采集和处理 各组大鼠分别于设定的时间点用 5％戊巴比妥钠 20mg／kg腹腔麻醉 后，立即打开胸腹腔，观察各脏器的改变，并取肺组织，按以下方式分别保 存： 1．于无菌条件下取材，取右肺上叶置于无Rnase的Eppendorf管中于 液氮和一70℃冰箱中保存。 2·取右肺下叶置于 0．二％DEPC的 4％多聚甲醛①．IMPBS，pH7．0－ 7．6）固定，24小时内常规脱水及石蜡包埋。 3．取 lrnm’肺组织，2．5％戊．二醛中固定。 三、实验方法 1．病理改变观察 问）大体观察：按照文献方法将肺出血分为5级：I级正常肺；11级肺 水肿