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卵巢癌PTEN基因失活和细胞外信号调节激酶的活化机制以及与卵巢癌耐药的关系

吕庆杰  
【摘要】: 前言及目的 卵巢癌是严重威胁妇女生命和健康的常见恶性肿瘤,其病死率居妇科肿瘤首位。近10年来,随着肿瘤细胞减灭术的广泛开展,新的化疗药物的不断出现,以及化疗方案的不断改进,卵巢癌的治疗效果大为改观,病人的生存质量明显改善,但5年生存率仍徘徊在30%~50%左右,化疗对其总体生存率并无明显改善。主要原因之一是化疗过程中产生原发或继发耐药现象。国内外研究表明,肿瘤耐药涉及癌基因的活化、抑癌基因的失活、细胞内药物浓度降低、药物靶分子改变、代谢解毒和DNA损伤修复功能增强、肿瘤细胞的凋亡抑制等多种机理,是多基因、多因素、多步骤综合作用的结果。 PTEN基因是一个具有双特异磷酸酶活性的抑癌基因,位于染色体10q23.3,由9个外显子组成。PTEN的失活在许多肿瘤细胞系和原发性肿瘤中都很常见。PTEN蛋白参与多种细胞信号转导通路的调节,与细胞的生长、分化和肿瘤的发生密切相关。有丝分裂原活化蛋白激酶(Mitogenactivated protein kinase,MAPK)信号转导途径是细胞内重要的信号转导系统,而细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-reguiated Kinase,ERK)通路则是该系统主要的和经典的通路,包括ERK1和ERK2,主要参与调节细胞周期及促进细胞增殖分化。已有研究证明,MAPK的活化与卵巢癌的发生、发展及恶性潜能的调节密切相关。多数学者认为,PTEN蛋白可能通过多种途径负调控ERK/MAPK信号通路的激活。最近的研究表明,PTEN基因失活及ERK/MAPK信号转导途径的异常激活可能与肿瘤的药物敏感性和耐受性有关。 本研究旨在从DNA、mRNA及蛋白水平探讨卵巢癌PTEN失活的机制以及与卵巢癌耐药的关系,探讨ERK1/2信号转导通路是否为PTEN的下 游作用元件以及该通路的过度激活是否与卵巢癌的耐药有关,为研制新的 抗卵巢癌药物、指导临床化疗方案的选择、提高疗效和防治复发提供新的思 路和理论依据。 方法 本研究收集了48例原发性上皮性新鲜卵巢癌标本,应用位于染色体 10q 23.3的4个多态性标记(DIOs541、D10s583、D10sl687和D10s2491), 采用PCR及杂合性缺失分析法,检测了PTEN杂合性缺失(LOH);采用聚 合酶链反应一单链构象多态性分析法(PCR一SSCP)检测了PTEN突变高发 的第5、第6、第7和第8外显子的突变;采用RT一PCR及免疫组织化学技 术检测了叮ENmRNA及蛋白的表达;采用Westem blot法检测了ERKI/2 蛋白的表达;同时检测了ERKI/2激酶活性的变化以测定其磷酸转移酶效 率;采用MTr比色分析法检测了卵巢癌原代细胞对12种常用化疗药物的 敏感性,其中包括:紫杉醇(PrX)、表阿霉素(EADM)、顺铂(CDDP)、卡铂 (CBP)、烃基喜树碱(HC件)、鬼臼乙叉贰(VP16)、长春地新(VDS)、唾替呱 (TSPA)、长春新碱(VCR)、丝裂霉素C(MMC)、氨甲喋吟(M仪)和5一氟 尿啼咙(5一Fu)。 结果 本研究结果显示,39.6%(19/48)的卵巢癌存在PTEN基因的LOH, PTEN突变率仅为4.2%(2/48),PTENmRNA表达缺失率为18.8%(9/48), 蛋白表达缺失率达27.1%(13/48)。PTEN蛋白表达缺失的病例,LOH的 发生率69.2%(9/13)高于表达阳性者的28.6%(10/35),差异明显(p二0. 019),说明PTEN蛋白表达缺失与LOH有关。13例PTEN蛋白表达缺失的 病例中,仅有2例(巧.4%)同时有突变和LOH,即存在双等位基因的结构 异常;7例(53.8%)有LOH,其中5例PTENmRNA表达缺失,另2例表达正 常;4例(30.8%)既无突变也无LOH,其中2例PTENmRNA表达缺失,另2 例表达正常。PTENmRNA和蛋白的表达与卵巢癌组织分型、分化及FIGO 临床分期无关。 卵巢癌ERKI与ERKZ蛋白表达水平呈线性正相关(r二0.526,p0. 01),而且以ERKZ表达为主。盯EN蛋白表达缺失的病例与表达阳性者比 较,ERKI/2酶活性增高1 .4倍(t=2.092,p=0.042),但ERKI/2蛋白表达 无明显差异。ERKI/2酶活性变化与ERKI或ERKZ蛋白表达水平均无相 关性(r=0.224,p二0.125;r=0.236,p=0.107)。ERKI/2蛋白和酶活性的 变化与卵巢癌组织分型、分化及FIGO临床分期无关。 不同类型的卵巢癌及同一类型的不同个体对化疗药物的敏感性差异较 大。卵巢癌对Pl,X、EADM、CBP和CDDP中度敏感,平均抑制率分别为67. 3%士4.6、54.5%土4.8、52.0%士4.3和50.8%土4.5;对VP16、HC件和 vDS低度敏感,平均抑制率分别为39 .6%士3 .8、39 .3%士4.3和30.7%* 2.6;而对MMc、TsPA、5一Fu、 VCR和MTX则耐药,平均抑制率均小于 30%。 卵巢癌PTENmRNA表达缺失的病例与表达阳性者比较,EADM、CBP 和CDDP3种抗癌药物的平均抑制率分别下降了近2倍(t分别为2.144、2. 463和2 .231,p0.05),CBp的耐药率升高了2.6倍(p=0.007)。盯EN 蛋白表达缺失的病例与表达阳性者比较,EADM、CBP和CDDP的平均抑制 率分别下降了近2倍(t分别为3.059、 2.410和2.183,p0.05),CBp和 CDDP耐药率分别增加了近2倍(p0.05),PrX的抑制率下降了1.2倍, PrX和EADM的耐药率分别增加了1 .8和2.3倍,但差异均不显著(p0. 05)。 卵巢癌ERKI/2酶活性与PTX和EADM的抑制率均成线性负相关(r 分别为一0.531和一0.488,p0.01),与CBP和CDDp的抑制


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