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逆转录病毒中介TNF-α基因转导的TIL抗人脑胶质瘤效应的实验研究

关俊宏  
【摘要】: 目的 本研究在人脑胶质瘤TIL细胞分离制备、TNF-α基因逆转录病毒载体转移系统构建的基础上,将TNF-α基因导入人脑胶质瘤TIL细胞中,放大TIL的体内外抗人脑胶质瘤效应。 方法 1.采用不连续密度梯度离心法从手术切除的胶质瘤组织中分离出TIL,并进行体外扩增和体外抗瘤活性测定。 2.在TNF-α逆转录病毒转移系统的建立及运载细胞TIL制备的基础上,利用构建的单克隆高滴度病毒细胞株PLC-2和PLJC-5将标记基因NeoR和目的基因TNF-α分别导入到TIL细胞中;对TNF-α基因转导后的TIL细胞进行细胞的增殖情况、TNF-α表达水平及对人脑胶质瘤TJ8510细胞的体外抗瘤活性的检测。 3.为了放大TIL的体内抗瘤效应,我们在利用TNF-α基因逆转录病毒转移系统将TNF-α基因转导至运载细胞-TIL中(TNF-TIL),并对其体外增殖、抗瘤活性研究的基础上,对TNF-TIL在人脑胶质瘤裸鼠模型体内的抗瘤效应进行观察。 结果 1.成功地从10例经手术切除的胶质瘤组织中分离出TIL,人脑胶质瘤TIL经IL-2体外扩增30天,TIL从1.1×10~4-2×10~6扩增到1.1×10~7-1 X 10\平均扩增 274。45倍,表明人脑胶质瘤 TIL体外在 IL-二作用下可得 到良好的增殖;人脑胶质瘤 TIL对 TJ85 10细胞杀伤活性与其培养时间相 关刀L经 IL-二培养 10天,呈现出对肿瘤细胞的杀伤活性,但杀伤活性较 低,而此时 LAK的杀伤活性明显高于 TIL;当培养20天时TIL杀伤活性迅 速增加,而LAK杀伤活性迅速下降,两者差异显著;30天时TIL杀伤活性处 于高峰,而LAK杀伤活性继续下降。提示人脑胶质瘤TIL对IL—2反应迟 钝,活化潜伏期长,而LAK细胞则相反,TIL体外抗瘤活性与增殖能力相关。 工基因转导前后,细胞的增殖情况未受到明显影响,证明逆转录病毒 中介的基因转移并不影响宿主细胞自身的功能皿L完全符合基因治疗中 运载细胞的要求;对’INF-。基因转导后的TIL细胞TNF-a表达水平的检 测结果显示:TNF-TIL细胞 TNF-。的分泌量远远超过 TIL细胞和 NeoR -TIL细胞;TNF-TIL细胞表达 TNF-二的动态观察结果:TNF-TIL细胞 在体外培养30天,可持续表达高水平的TNF-a,说明导人TNF—a基因已 完整、稳定地整合于TIL细胞基因组中并获得了表达。比较TIL、NeoR- TIL和 TNF-TIL三者的抗瘤活性,本实验结果表明:转导 TNF-a基因的 TIL细胞对人脑胶质瘤TJ85 10细胞的体外抗瘤活性明显提高,与TIL和 NeoR—TIL相比差异显著,我们认为这是由于 TNF—a基因转导TIL细胞 后,能持续高水平地分泌内源性的TNF—a,从而放大了TIL自身的抗瘤活 性。 3.局部转输TNF一TIL和静脉转输TNF-TIL均能明显抑制裸鼠皮下 肿瘤的生长,且抑瘤效果高于TIL治疗组nL静脉转输无明显抑瘤效果, 说明TNF-a基因转染TIL放大了TIL的体内抗瘤效应;而局部转输TNF- TIL较静脉转输TNF-TIL对肿瘤生长的抑制效果更为明显,提示过继性免 疫治疗胶质瘤以局部转输方式为佳。虽然静脉转输TNF—TIL的治疗效果 不及局部转输,但也能抑制人脑胶质瘤裸鼠皮下实体瘤的生长,与单纯静脉 转输TIL的抑瘤效果差异显著。我们认为其原因可能是:①TNF-a基因 转染后,放大了肿瘤局部TIL的抗瘤效应;②.血循环中的TNF-TIL分泌 的TNF-a可能在一定程度上发挥了全身抗肿瘤作用。 ·2· 结 论 l.人脑胶质瘤TIL具有良好的体外增殖能力,逆转录病毒中介TNF- a基因导人人脑胶质瘤TIL后,其体外增殖能力末受明显影响,符合人脑胶 质瘤淋巴因子基因治疗运载细胞的要求。 2.逆转录病毒中介TNF-a基因导人人脑胶质瘤TIL后,能持续\稳定 地表达TNF-a,其体外抗瘤活性高于TIL,两者差异显著。 3.逆转录病毒中介TNF-a基因导人人脑胶质瘤TIL后,放大了TIL 体内抗肿瘤效应,肿瘤局部转输和l静脉转输TNF-TIL对人脑胶质瘤裸鼠 皮下实体瘤的均有明显的抗瘤效应,以局部转输方式为佳。


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