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bFGF诱导的增殖人晶体上皮细胞内Ca~(2+)调控的初步研究

曲勃  
【摘要】: 白内障为世界上致盲疾病之首,但目前为之有效的治疗手段仍然是手术治疗。但术后,很多患者出现了晶体后囊混浊,即后发性白内障(PCO),导致视力再度下降。虽然手术或激光后囊切开是一较为有效的治疗方法,但后囊膜的开通可导致视网膜脱离、黄斑水肿等严重的并发症,为患者再次造成痛苦和损失。因此,如何预防和药物治疗白内障及后发障是目前眼科工作者亟待解决的迫切问题。 已证实,术后晶体上皮细胞(LEC)的残留和增殖是后囊膜混浊的形成基础。生长因子(GF)在此过程中发挥着极为重要的作用,是促进术后LEC增殖,分化,移行引起后发障的主要因素,其中bFGF的作用尤为突出。 研究发现:晶体细胞内钙也有着明显地促晶体上皮细胞生长作用;许多生长因子如EGF、PDGF、bFGF对某些细胞内Ca~(2+)有一定的调节作用;而钙动员对生长因子也有一定的调节作用,在一些实验中发现细胞内Ca~(2+)的释放也可增加小脑颗粒神经元内bFGF的表达。二者在细胞内信号转导和细胞增殖、分化过程中存在着相互作用。 基于以上背景我们作出大胆推测:在晶体上皮细胞中,GF对Ca~(2+)也存在着一定的调节作用,这种调节引起的钙动员可能也参与了GF促细胞增殖过程,并发挥着协同的作用。因此,找出GF与Ca~(2+)的关系,发现它们的作用方式,特异性阻断两者在晶体上皮细胞增殖过程中的相互作用,将为白内障尤其是后发障的预防和治疗提供更为广阔的思路。 为证实所作推测,本实验从晶体上皮细胞内钙库通道三磷酸肌醇受体(IP3R)和Ryanodine受体(RyR)入手,首先判定它们在人晶体上皮细胞(HLEC)内的表达,推断它们在HLEC内Ca~(2+)调节中的作用,然后用bFGF诱导HLEC增殖,检测bFGF对HLEC内Ca~(2+)、IP3R、RyR的作用,最后通过药理反应推断bFGF对HLEC内Ca~(2+)的作用途径, —— 为进一步药物阻断GF与Ca卜之间的相互作用从而抑制晶体上皮细胞的 增殖提供了理论基础。 方 法 第一部分: 卫、人晶体上皮细胞系传代培养 2、取第三代细胞,TRIZOI试剂舰 HLEC内和各受体亚型阳性对 照组织内总RNA(阳M照组织选自足月死婴),RT-PCR方法检测 HuC内 IP3RI,11,Ill和 RyRI,11,Ill亚型 m删的趟。各弓;物根 据NCBI公布的人类以上各受体mRNA序列触用软件Primer3所得。 实验均重复四次,Kodak ID digital science凝胶图像撕软件撕凝胶 电泳结果,计算目的基因mRNA的相对含量,作两样本均数差异的t 检验。 3、取同代细胞传代与30mm培养皿中,在激光扫描共聚焦显微镜 下(LSCM)向各组内分别加入一定浓度乙酚胆碱、阿托品、咖啡因、 yanodine、普鲁卡因溶液(各物质均溶解于不含有 C扩”,Mgl”的 PBS 液中,在 37 C下孵育 20分钟)通过观测相对荧光密度实时观察细胞内 Caz”变化。 第二部分: 1、w*F诱导*LE C体外增殖及测定:选取第三代培养细胞,以 浓度为 10帅1加入 96孔培养板中,每孔加 100…含 2%FSC的 DMEM,与孵箱内培养2-3小时,待细胞贴壁。之后向各孔分别加培 养液稀释后的***F10O卜 使其终鹏分别为且n咖互,二ong/ml,100 n咖I,阴性对照每孔加 DMEM 100…。各浓度梯度及对照组各 3孔。 第三珊行MTf测定。各组比色阶t检验。 2、RT-PCR检测 10n卵lbFGF 作用后的HuC内IP3R和RyR 各亚型mRNA表达变化 3、LSCM下检测 Inghl,10ng/ml,100 "g/ffil bFGF作用后第三天 HLEC内静息Ca卜浓度变化。 第三部分: 取第三代细胞,在激光扫描共聚焦显微镜下向各组内分别加入 2 ———— 10nghl bFGF,10mM咖啡因;10mM Ryanodine、50InM普鲁卡因溶 液,05mM Genistein,通过MI细胞内相对荧掷度实时观察细胞内 Cah 变化。 结 果 第一部分: 1、传代后的细胞24小时后几乎完全贴壁,细胞呈多形性,第三代 细胞出现大量梭状或长条状。细胞分裂较快,36小时即开始增殖。在 接种密度为 105细w毫升时,一周内即可连接成片。 2、HLEC存在IP3RI、Ill型和RyRI、Ill型m聊表达,且都以* 型表达为主。P(1oR)<0*5;P(RyR)<0.0】 3、10pM Ach在细胞外液含Ca卜,Mg卜的翩下,可腿G;起HLEC 内[Ca卜]的升高,IPM阿托品即可基本阻断 Ach的作用。在细胞外 液无 Cah,Mgl“含 lmM EGI?A时,Ach仍能较迅速引起[Ca卜]的升 高,但较前者持续时间短;1()mM Caffeine可腿引起细胞内【Ca卜] 的逐步升高,幅度较Ach小,但持续时间较长。另一方面,追加10pM Ach, 并未再次弓!起[Caf”]的升高;50pM Ry。flodillC使细胞内钙[C。‘”] 浓髓慢升高,持续时间舰长,幅度与Caffeine相似;50PM Procaine 可显著抑制Ryano山ne的活性。 第二部分: l、MTI’测定结果bFGI’呈浓度懈性诱导HLEC的增殖,其中 10fig/ml的作用最为显著。P刃* 2、bFGF诱导后 HLEC实鞭和对照组内仍然可见 IP3RI、Ill,RyRI、


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