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细胞外信号调节激酶与蛋白激酶C信号转导通路及即早基因表达在铅暴露小鼠记忆功能改变中的作用

侯伟健  
【摘要】: 一、慢性铅暴露小鼠脑组织蛋白激酶C活性变化及其与记忆行为改变的关系 前言 学习记忆是脑的高级功能,其物质基础是中枢神经系统高度的可塑性,包括神经网络、神经环路及突触连接等不同水平的可塑性。它既包括传递效能的变化,又包括形态结构的变化,二者的物质基础都涉及神经元和突触部位的某些蛋白质、受体、神经递质、离子及信使分子的物理化学变化。某些影响大脑学习记忆功能的毒物也是通过干扰中枢神经可塑性及信号转导过程而发挥其毒性作用的。 重金属铅是一种普遍存在的环境神经毒物,其对儿童的神经发育毒性已被许多研究所证实。铅具有很强的神经亲和性,可在神经组织中蓄积,引起神经系统功能(主要是学习记忆功能)的长期损害。目前铅神经毒作用机制研究中的一个重要内容就是探讨铅对中枢神经细胞信号转导过程中的两个重要因素—钙和蛋白激酶功能的影响。后者如蛋白激酶C(protein kinase C,PKC),细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated protein kinase,ERK)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)等。 本研究以细胞信号转导途径为线索,分别探讨了PKC、ERK、NOS1等信号分子及即早基因(c-fos,c-jun)在慢性铅暴露小鼠脑细胞中的活性、蛋白表达及mRNA表达的改变,以及铅暴露小鼠记忆行为的变化,并将细胞中信号分子的改变与记忆功能改变结合进行分析以寻找一些内在规律。 蛋白激酶C是一种钙活化的、磷脂依赖性的丝氨酸/苏氨酸激酶。在 调控细胞的许多生理过程,特别是在细胞内信息传递途径中,PKC起着一 个关键的作用。目前,在铅的神经毒性研究过程中,铅对PKC的作用引起 人们极大关注。这是因为铅比钙对 PKC有更高的亲和力。现已知,Ph卜可 以取代Caz”激活蛋白激酶C。铅取代钙后可扰乱PKC的正常激活,导致 PKC反应敏感性下降,扰乱PKC在学习记忆中的正常功能。本研究在第一 部分中利用卜/中〕-A’fP体外磷酸化法进行脑组织胞浆和胞膜的PKC 比活性测定,并进行了铅暴露小鼠记忆行为学测试。 实验材料 昆明小白鼠,由中国医科大学实验动物部提供;交配后,通过饮水饲喂 不同浓度铅,产仔后按出生 l在上 5上2上0日龄取材; h/1-ATP购于北京亚辉生物工程公司; 鱼精蛋白(Protami*)、抑蛋白酶肽(aProtinin)、胃酶抑素(PePStatin)、亮 肽素OeupeptinX苯甲基磺酚氟沙MSF)等均购于Signa公司; 二硫苏糖醇(D TI’TI’入HE陀S工GTA等购于华美生物工程公司; Siglna 3 K30型高速低温高心机; Beckman ie3801型液体闪烁计数仪; 小鼠记忆测试(被动回避反应)明暗箱装置由沈阳医学院生理教研室 制作。 实验方法 1.小鼠慢性铅暴露:通过饮水饲喂浓度为0.5上.4/.8*.2J.6、 14.4mmol/L的醋酸铅水溶液。对照组饲喂自来水。 2、利用一/刊一ATP体外标记磷酸化方法进行小鼠脑组织胞浆 PKC 活性测定。 3、利用*/印]-ATP体外标记磷酸化方法进行小鼠脑脑组织胞膜 PKC活性测定。 4、利用小鼠被动回避实验(PAR)进行铅暴露小鼠记忆行为学检测。 ·2· 实验结果 不同浓度醋酸铅暴露的不同发育时段小鼠大脑细胞浆中PKC活性有 不同程度的变化。l)铅暴露小鼠脑胞浆PKC活性与正常组相比可见一定 的差异,多数组第15日问)为最高峰,低浓度染铅组在某些时段中PKC 比活性高于正常组,而随着铅浓度的升高,这些时段的PKC活性逐渐降低, 较高铅浓度组酶活性均低于正常组;InunoVL汐)组的 P22以后,比活性迅 速升高,至P30时比对照组高出很多。2.4mmoUL铅暴露组的PKC比活性 在* 至 P22则不但未见降低,反而继续升高m2至 ppo又继续升高,成 为最高点。2)铅暴露小鼠脑细胞膜PKC活性总体上比胞浆低,PKC活性高 峰时段在 P 2 2左右,胞膜 PKC活性随铅浓度的升高而升高。其中 9.6nunoUL组升高最为明显。当铅浓度达到一定程度后,胞膜的PKC比活 性又降低。3川鼠活体记忆行为D!!练测试可见,训练初期低浓度铅暴露组 的记忆保持时间略高于正常组,而高浓度铅暴露组的记忆保持时间低于正 常组。训练后期低浓度组与高浓度组记忆保持时间均低于正常组。 讨 论 正常对照组小鼠脑细胞浆 PKC活性在 PI至 PS期间增加较缓,而在 PS 至n 段迅速增加,并达到高峰,从n 至P22段又明显降低n 为低谷, 而后 P30又升高。 铅暴露鼠脑胞浆中PKC活性高峰也在P15左右,有些染铅组p. 4pmol/L刀KC活性由于过度激活在P22和P30在段活性持续升高。不同 浓度的铅对不同发育时段的PKC活性有不同程度的激活或抑制。低浓度 铅可引起PKC的激活,而较高浓度暴露则引起PKC活性抑制。小鼠脑细胞 膜 PKC活性以 P22为最高点,并且其活性随铅浓度升高而升高。 正常对照组小鼠在8!!练最初记忆保留时间缓慢增加,而随


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