诱导型一氧化氮合酶在人腹主动脉瘤组织中的表达及其病理生理作用的研究

【摘要】： 前言 腹主动脉瘤(Abdominal Aortic Aneurysm，AAA)是严重威胁人类生命健康的疾病，在西方60岁以上人群的发病率超过了3％。该病近年来在我国的发生率呈不断上升趋势。最近国际上的一些研究者正在探索对于小的，无症状的AAA采用药物介入治疗，以达到控制其发展，防止其破裂的目的，并且能够为今后的手术治疗创造有利的时机。因此，分子生物学水平上深入研究和认识AAA的病理生理机制显得越来越重要。总结以前的AAA病因学研究成果，我们发现多种因素导致了AAA的形成。其中，腹主动脉壁弹力纤维和胶原纤维的降解破裂是其形成的直接因素。炎性细胞侵润是AAA的病理特征，并且被认为是分泌基质金属蛋白酶(Matrix Metalloprotainases，MMPs)降解弹力蛋白和胶原蛋白的细胞。另外，近年的研究还表明，AAA的形成伴随着腹主动脉中层平滑肌细胞(Smooth Muscle Cell，SMC)凋亡的增加和数量的显著减少。 除了这些比较清楚的对AAA发病机制的认识，最近的一些研究转移到AAA病因学的另一个分支(一氧化氮(Nitric Oxide，NO)在AAA形成中的作用。主要是由于在过去的二十年里，对于NO生理和病理的研究和认识的增加十分迅猛，特别是在心血管领域；而对于NO在AAA形成中的作用依然是十分有限。对于NO的作用的研究，极有可能揭开AAA病因学研究的一个新的领域。 NO是在NO合成酶(Nitric Oxide Synthase，NOS)催化下L-精氨酸氧化后生成的。NO是稳定的无色气体，具有中度的水溶性，在溶液中的半衰期为30秒，经氧化作用生成硝酸盐和亚硝酸盐。大量实验研究表明，一方面，NO具有细胞保护作用；另一方面，NO对细胞又具有损伤作用。在特定的条件下，NO可以形成一种强力氧化物—过氧化亚硝酸盐(Peroxynitrite，ONOO~(2-))，半衰期为1秒。过氧化亚硝酸盐降解产生一种活性氢氧根自由基(HOONO)，对细胞具有毒性作用。过氧化亚硝酸盐和其降解产物将导致脂质的过氧化、以及导致调节酶功能及信号传导的酪氨酸分子的硝酸化，所有这些作用都将导致细胞的损伤。 NOS在血管中存在的形式是一族结构相关但又有差异的同分异构体， E内皮细胞型一氧化氮合酶（endothelial Nitric Oxide Synthase，eNOS）和诱 导性一氧化氮合酶（inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS）。eNOS产生于 内皮细胞，由eNOS催化产生的NO水平较低，对血管具有保护作用；相反， iNOS则广泛存在于体内很多类型的细胞中，一经诱导将产生大量的NO。 大量的NO不但导致ECM的损伤、引发细胞的毒性作用，而且对细胞的生 长和细胞的凋亡具有重要的调节作用。人类iNOS的基因定位在第门号染 色体上。iNOS的诱导剂包括内毒素汀－干扰素、白介素－1J瘤坏死因子 －a等。 最近的研究表明，AAA组织中亚硝酸盐离子的浓度明显高于正常腹主 动脉，这种高浓度的亚硝酸盐将导致弹力纤维的损伤。进一步的研究表明 由亚硝酸盐离子引起的硝化作用在慢性弹力蛋白退性行变疾病（如 AAA） 的发病过程中起十分重要的作用。Johanning等的研究采用AAA实验动物 模型选择性抑制iNOS，结果显示0O的生成被抑制，同时AAA的扩张也 受到抑制。lwashina等的实验通过对血管SMC进行iNOS cDNA的转染，导 致iNOS的过渡表达和大量NO的产生，进而导致SMC的大量凋亡。另外， 临床和实验中采用的很多抑制MMPS的药物如强力酶素、心得安、甲基强的 松龙等都具有抑制NO的产生的作用。 所有这些证据表明iNOS及NO在AAA形成和发展中发挥了重要作 用。但迄今为止，iNOS在人AAA组织中的表达及其分泌的细胞还没有明 确报道。以前的实验研究都是间接地引用其他血管疾病的证据。为此，本 实验采用分子生物学的方法联合免疫组化探查iNOS在AAA的表达；同时 探查NO氧化反应的终产物之—一硝基酪氨酸在AAA组织中的表达，验证 NO的损伤作用；以及通过探查AAA中细胞的凋亡来进一步验证NO的细 胞毒性作用。为NO在AAA形成中的病理生理作用提供证据，为最终iNOS 在临床的应用、控制AAA的发展和治疗AAA提供理论依据。 方 法 实验组25例人AAA标本采自择期AAA手术的术中患者，平均年龄69 岁（年龄范围55岁－80岁八AAA经多普勒超声人T扫描及DSA确诊，平 均直径6．7cm（范围3．scm－9．ocm）。患者24例（96阮）为男性，l例 ·2· k％）为女性。对照组川例正常腹主动脉采自器官移植手术中的供体，无 既往动脉瘤或阻塞性动脉疾病史，平均59岁，7例为男性门0％厂3门0％） 例为女性。AAA及正常腹主动脉各例切片均性常规HE染色，检查包括弹 力纤维的分布JMC．炎性细胞浸润情况等。AAA及正常腹主动脉各例切 片均行抗－CD3人D20人D68的免疫组化染色，来检测炎性细胞的类型。采 用 iNOS CDNA寡核昔酸探针通过原位杂交来探查人AAA组织及正常腹主 动脉组织中 iNOS mRNA的表达，联合免疫组化方法对原位杂交阳性细胞进 行复染以鉴别其细胞类别。采用免疫组化的方法探查iNOS在AAA组织正 常腹主动脉组织中的蛋白表达；以及采用免疫组化的方法探查NO氧化反