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蕈样肉芽肿和B细胞淋巴瘤T细胞抗原受体γ基因重排的研究

宋丽新  
【摘要】: 前言 蕈样肉芽肿(MF)是一种低度恶性的皮肤T细胞淋巴瘤。其早期表现可多种多样;病理上早期诊断尤其困难,多需要反复的活组织检查,有时要待病情进一步发展才能确诊。免疫组织化学技术检测MF皮损中T细胞分化抗原虽可作为辅助手段,但多难以确定皮损的良恶性。淋巴细胞恶性增殖的主要特点是克隆性增殖,在T淋巴瘤表现为T细胞抗原受体(TCR)的单克隆性重排。自八十年代以来国外学者应用Southern杂交技术(SBA)检测TCR-β基因重排,或聚合酶链反应技术(PCR)检测TCR-γ基因重排,但由于Southern杂交技术需要新鲜的标本,且肿瘤细胞的数量占总被检查数量的1%-5%才能检测出,费力、耗时、且具有放射性,故目前已被PCR技术取代。由于γ基因重排几乎出现在所有T淋巴细胞及T淋巴细胞瘤,且结构简单,故PCR法简便易行。目前国外采用的技术为聚合酶链反应(PCR)/琼脂糖凝胶电泳、聚合酶链反应(PCR)/聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、聚合酶链反应(PCR)/变性梯度凝胶电泳(DGGE)、聚合酶链反应(PCR)/温度梯度凝胶电泳(TGGE)、聚合酶链反应(PCR)/单链构象多态分析(SSCP),国内于九十年代中期亦开展了一些类似的研究,由于引物的数量和设计及PCR产物的检测手段的不同,这些研究显示蕈样肉芽肿(MF)的TCR-γ基因重排阳性率在52%-90%之间,虽然国外一些学者应用PCR/DGGE、PCR/SSCP技术检测TCR-γ基因重排的阳性率在80%-90%左右,但亦存在假阳性,如在湿疹和神经性皮炎中亦检测出6%的TCR-γ基因重排,我们认为在灵敏度和特异性上应该保持平衡。目前该研究仍处于进一步探讨中,但主要攻关点之一是开拓一种较强临床应用前景的 基因诊断方法。然而,目前国内外研究中所报道的大多数方法均较繁琐 (如多重PCR),而且耗时、费力,需要特殊的仪器设备(DGGE),甚至有的检 出率虽高,但假阳性率亦高(如PC形DGGE),这些都影响其临床的实用性。 为了进一步提高该研究的临床实用价值和科研价值,我们对不同病种、不同 种类取材标本,在DNA提取、引物设计和检出率等方面进行了系统的研究, 取得了一定突破。1.国内外对于MF疾病的石蜡包埋组织提取DNA方法 上基本采用酚氯仿法,我们借鉴“一步法”,在国内外首次用于MF疾病的石 蜡包埋组织提取DNA上,使提取DNA一步完成,且提高了MF组织的利用 率,同时采用巢式PC邵琼脂糖凝胶电泳方法检测TcR一,基因重排,该方 法是目前国内外报道的最简便、快捷、灵敏度和特异性较高的方法,该方法 使操作程序化为临床更好应用,提高了基因诊断的价值;同时“一步法”提 取石蜡包埋组织的血A亦可用于大量的回顾性研究;2 .MF患者外周血中 存在TCR一,基因重排,但阳性率不太高,且可以在皮损中无TCR一,基因 重排存在的情况下单独存在,之前国内尚未有报道。 实验材料和方法 一、提取DNA的方法: 1.提取石蜡包埋组织DNA的“一步法”:将石蜡包埋组织切成6卿的 薄片,每例切18张,装人离心管,常规脱蜡后,每个小管中加人变性缓冲液 100醉,55℃水浴17h。离心后留上清4℃冰箱保存备用。同时应用微卫星 引物做PCR验证提取DNA的质量。 2.提取新鲜皮损及外周血DNA采用传统的酚氯仿法,将提取的DNA 用紫外分光光度计测定260lun和Zsolun的光密度(OD),确定OD260/ OD280Iun值并根据OD值计算DNA的浓度和纯度,然后用TE缓冲液调浓 度至100卜扩d。 二、TCR一,基因的PCR扩增: L采用TCR一,基因的v,1一8/J,和v,9/J,引物,用巢式PcR法检测 32例MF石蜡包埋组织的基因重排,同时对2例可疑MF(最后发展为 Mr)、5例湿疹、5例类银屑病(急性痘疮样苔癣状糠疹)、5例神经性皮炎患 者、5例正常皮肤的石蜡包埋组织进行TcR一,基因的检测。 2.采用TCR一,基因的v,1一8/J,和v尹/J,引物,用巢式PCR法检测 14例MF患者的14份外周抗凝血和14份皮损的TCR一,基因重排,同时 对17例可疑MF、8例湿疹、8例神经性皮炎、1例红皮病患者、5例正常人的 皮损和外周抗凝血进行TCR一,基因的检测。 3.采用TCR一,基因的v,1一8/J,和v尹/J,引物,用巢式PCR法检测 28例B细胞淋巴瘤石蜡包埋组织的TCR一,基因重排。 实验结果 一、“一步法”和酚氯仿两种方法对不同储存时间的石蜡包埋组织提取 DNA的检出率: 1.58例标本中”一步法”和酚氯仿法提取的DNA经PCR扩增总阳性 数分别为45例和犯例(x,=6.52,p0.05); 2.23例保存6一10年标本中,“一步法”和酚氯仿法提取DNA经PCR 扩增后阳性数分别为16例和8例(x,二5 .57,P0.05); 3.35例保存1一5年的标本中,”一步法”与酚氯仿法提取DNA经 PcR扩增后阳性数分别为29例和24例(xZ=1 .32P0 .05)。 二、石蜡包埋组织的TCR一,基因重排检出结果: 1.MF患者:32例患者中有23例检测TCR一,基因重排,其检出结果 的阳性率为72%。其中4例三期TCR一,基因重排检出阳性率100%,28 例二期检出阳性率为67.9%。 2.可疑MF患者(最后发展成为MF):2例可疑MF患者中1例检测出 TcR一,基因重排。 3.非MF患者(湿疹、神经性皮炎、急性痘疮样


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