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CILP在骨关节炎和类风湿性关节炎中自身免疫作用的研究

姚振宇  
【摘要】: 前言 90%的软骨细胞外基质是由胶原和蛋白多糖组成的。伴随着关节软骨破坏的炎症性关节炎通常与对Ⅱ型软骨胶原和软骨蛋白多糖的自身免疫反应有关。近年来,一些非胶原、非蛋白多糖类的软骨蛋白在研究中被发现。软骨间层蛋白(Cartilage Intermediate Layer Protein,CILP)是一种近年来被克隆的软骨特异性蛋白,其分布只局限于软骨组织特别是在软骨中间层分布丰富。到目前为止,其在软骨组织中的限定性分布的原因仍然是一个谜。编码CILP的mRNA由2部分组成,氨基端为CILP(91.5Kda),羧基端编码猪核苷酸焦磷酸水解酶(Porcine Nucleotide Pyrophosphohydrolase,NTPPHase,58.5Kda),二者中间存在Furin的切割位点。而且,其表达随年龄而增加,且在人类关节炎早期阶段可见其表达增加,所以,CILP很可能在软骨的生理性降解和骨关节炎的病理机制方面发挥重要的作用。 骨关节炎(Osteoarthritis,OA)通常被认为仅仅是一种非炎症性的降解性疾病,然而近年来大量的研究表明,和类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)相似,骨关节炎的发病机理中,免疫系统也扮演着重要的脚色。首先,在OA的病人的滑膜组织中经常可以发现有激活的T细胞浸润,并且有T细胞的克隆性增殖现象。再者,在OA病人中可以观察到针对来自软骨基质成分的自身抗原的自身免疫反应。最后,以这些软骨来源性的大分子蛋白免疫动物可以在动物模型中诱发关节炎。综上所述,在关节局部,针对软骨基质或其相关蛋白的免疫反应在OA及RA中可能对软骨的降解过程具有重要的调控作用。 在本研究中,我们对近年来克隆的软骨特异性蛋白CILP进行了骨关节炎和类风湿性关节炎中自身抗原作用的研究。并应用CILP蛋白在小鼠中 诱发了多发性关节炎的表现,研究了这个关节炎动物模型的病理学和免疫 学的特点。我们的研究结果强烈的提示在关节炎的致病机制中,CILP可能 具有活跃的诱发自身免疫反应的作用。 材料方法 一人ILP基因重组蛋白的亚克隆构建及诱生表达 1.人CILP基因的亚克隆;基于文献报导的CILP的基因组序列,我们采 用RT-PCR的方法,从骨折病人关节软骨细胞基因组中特异性扩增出 CILP基因组氨基端的前半部分 CDNA序列*,64-999hp人和后半部分 山NA序列*,976-203 hP人并且进一步将 CZ亚克隆成三个首尾互相 重叠的小片段,分别命名为 CZFI(396 bps,976 hp-137foP)、CZry(399 bPS,1327 hP-1725 hP)、CZF3(351 bPS,1681 hP-2031hP),其PCR产物 经双脱氧基因测序加以确定。 2.CILP基因重组融合蛋白的构建:我们将0”99 hP入CZ(,056 hP),CZFI(396 hP),CZTh(399 hP),以及 CZF3(35 hP)的 CDNA经 PCR扩增后的产物与载体 pTEX-2-eHishEX质粒的衍生物,其驻基端含 有六个组氨酸残基,可便于亲合层析)质粒连接,然后.这些融合载体被重 组人大肠杆菌 POP 2136菌株中构建了 CILP-p一半乳糖着酶*ILP-p- gal)重组融合蛋白。为了更好的研究 CILP的免疫学抗原表位,我们进一步 采用PMAL-eHis仲MAL-CZ质粒的衍生物,竣基末端多克隆位点带六个 组氨酸残基,可便于亲合层析)为新的表达载体导人大肠杆菌DH5a菌株 中重新构建了CILP各片段的CILP一麦芽糖结合蛋白(CILP-MBP)重组融 合蛋白。其插人子DNA序列经双脱氧基因测序和电泳加以确定。 3.CILP基因重组融合蛋白的提纯:细菌裂解液中的重组蛋白被用亲和 层析的方法提纯,以 SDS—PAGE,Western Blot鉴定重组蛋白性质。提纯后 的重组蛋白浓度用Bradfrd方法加以检测。 二、骨关节炎和类风湿性关节炎中CILP自身免疫作用的研究 1.骨关节炎和类风湿性关节炎病人血清中CILP自身抗体的检测:用 酶联赅吸附试验和Western Blot方法检测了105例骨关节炎和88例类风 湿性关节炎病人和正常对照组人群的血清标本。 ·2· 2.CILP融合蛋白对小鼠的免疫:采用CILP-p-gal重组融合蛋白为 抗原对 DBA/IJ,ICR,C57BL/6及 BALB八 4种小鼠进行免疫,观察其关节 部位的病理变化,并对其病变关节进行组织化学染色检查。 三人ILP重组融合蛋白诱发的C57Btr6小鼠关节炎模型的建立一CILP 关节炎性抗原表位的研究 1.C57BL/6小鼠关节炎模型的建立:我们用CILP对小鼠进行免疫,从 .而诱发了多发性关节炎的病理表现,进一步取u用CILP各片段抗原多肽来 免疫C57Btr6小鼠,利用MHC纯合型小鼠C57BL/6来研究CILP基因组中 的关节炎性抗原表位。 2.小鼠体内针对CILP的细胞增殖和体液免疫反应 3.小鼠病变的关节部位X光检查 4.CILP免疫小鼠体内的NTPPHase活性检测 实验结果 一人ILP基因重组蛋白的亚克隆构建及诱生表达 1.人CILP基因的亚克隆及基因重组融合蛋白的构建:核酸电泳及SDS -PAGE、Western Blot、基因测序结果表明我们成功地构建了CILP一队gal 和 CILP-MBP重组融合蛋白。 2.CI


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