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幽门螺杆菌对克拉霉素耐药的分子基础

郝庆  
【摘要】: 目的:探讨寻找一种简便的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)分离、培养及保存、复苏方法,观察经过不同培养时间(3天,7天)时H.pylori菌落及镜下菌体的形态,采用一种新的细菌保存方法,观察H.pylori处于不同形态时保存1年后复苏的成功率;并采用E-test方法检测沈阳地区感染的H.pylori对4种不同抗生素,即克拉霉素、甲硝唑、阿莫西林及四环素的最低抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration,MIC)值,观察沈阳地区的H.pylori对各种抗生素的耐药情况,并对其中筛选出的对克拉霉素耐药的H.pylori菌株,PCR法扩增其23S rRNA基因中2047-2347之间的片段,并对该片段进行序列分析,观察耐药株的耐药机制。 方法:首先对有消化系统症状的患者,进行胃镜检查,对其中消化性溃疡、慢性胃炎及胃癌等病人,取胃窦粘膜1块,经快速尿素酶实验证实为比pylori感染阳性者,再取胃窦粘膜2块,无菌条件下切碎,接种于含10%新鲜脱纤维兔血的Columbia平板培养基,置于厌氧培养罐中,封盖,负压抽成真空,再灌入微需氧气体(5%O_2,10%CO_2,85%N_2),于37℃、90%以上湿度的条件下培养3天,观察菌落形态及Gram染色后显微镜下菌体形态,并经尿素酶、氧化酶及触酶实验证实为H.pylori,取典型菌株进行传代纯培养,分别于不同培养时间(3天,7天)时,用无菌棉签将平板上的H.pylori菌株移入装有3ml灭菌脱脂奶的小瓶中,封盖,于-80℃深低温下保存。一年后,随机取出传代培养3天和7天时保存的H.pylori菌株,共8株,分别接种于Columbia血平板培养基,进行复苏。在传代培养中,取H.pylori纯菌落,用无菌生理盐水配制成浓度为1McFrand的菌悬液,用无菌棉签蘸取H.pylori菌液均匀 涂布于含10%新鲜脱纤维兔血的Muel ler一Hinton培养基中,在15 分钟内将E一tset试纸条帖于培养基中央,并立即开始于37℃、微 需氧条件下培养,3一5天后观察H.pylori生长情况,读取 H.pylori对不同抗生素的MIC值,判断H.pylori的耐药性,耐药 标准:克拉霉素MIC值)smg几,甲硝哇Mlc)8 mg几,阿莫西林 Mlc值)Zm叭,四环素Mlc值)sm叭。在一80℃深低温下保存 的H.pylori中,选出其中对克拉霉素耐药的H.pylori菌株3株, No.13(MIC smg/L),Nol7(MIC 64 mg/L),No22(MIC )256mg/L),及敏感株1株,No.33(MIC 0.125mg/L),进行复苏 后,用0.01M的PBS lml将菌膜从Columbia平板上冲洗下来,冲洗 液收集于1.5ml enphendoff管中,3000r/smins进行离心,取沉 淀,采用酚一氯仿方法提取H.pylori的DNA。按文献报告资料设计 引物,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成引物,上游引物 序列为:5,一CTG CAT GAA TGG CGT AAC GAG一3,(与 H.Pylori 235 rRNA基因序列中2047一2067片段碱基互补),下游引 物序列为:5,一GAG CGA CCG CCC CGA TCA AAC一3,(与 H.Pylori 235 rRNA基因序列中2347一2327片段碱基互补)。PCR 循环体系共Zoul,其中包括 dd HZO(双蒸水)13.3ul,lox pCR buffer 2.5ul,dNTPS(2.SlnM)2ul,Taq酶(su/ul)0.2 ul,引物 (1:sx)1.5ul,DNA Sajnple 0.5 ul.PCR循环条件为:94oC4分 钟,94℃40秒,61.5℃1分钟,72℃1分钟,72℃7分钟,共进行 32个循环,扩增产物跑870聚丙烯酸胺凝胶电泳,观察PCR产物纯 度。选择电泳条带单一而明亮的样品,按上述条件扩增SOul,将含 有PCR扩增产物的enphendoff管装入冰盒中,送交上海生工生物工 程技术服务有限公司,进行序列分析,比较耐药菌与敏感菌的235 rRNA基因中目的片断的序列,以确定与耐药有关的突变情况。 结果:1.H.pylori菌落为针尖状,半透明,原代培养中菌落 稀少,不融合。GraJIn染色后,镜下(1000x) H.pylori在不同培养 时间分别呈现不同形态,如弯曲状、杆状或短棒状、球状,将后二 者重新传至新鲜培养基后,形态可恢复至弯曲状或杆状。1年后, 随机取出培养3天时于脱脂奶中深低温保存的6株H.Pylori,均复 苏成功;而培养7天时即球形体时保存的菌株未能复苏成功。复苏 的H.pylori菌落大小、形态一致,且较密集,呈半融合状态。镜下 观察H.pylori菌体为弯曲状或杆状,少数H.pylori菌体变长,更 加弯曲,类似丝状。 2.30例H.pylori菌株中有7例对克拉霉素耐药(MICS在 8一256mg/ml),耐药率为23,3ry0;12例对甲硝哩耐药(MICS在24- 256mg/ml),耐药率为4Oyo;O例对阿莫西林耐药,耐药率为O%,2 例对四环素耐药(MIC分别为16mg/ml和32mg/ml),耐药率为6.7%。 3.PCR扩增产物为30lbp的核普酸片断,电泳图谱提示 反应体系中只含有单一的目的片断,无污染、无杂带。No.33为克 拉霉素敏感H.pylori菌株,No.13、17、22分别为低度、中度及高 度克拉霉素耐药的H.pylori菌株。从基因测序图谱中可以发现: 敏感株No.33共测出278个碱基,与敏感菌(No.33)序列比较, No.13(低度耐药株)共测出279个碱基,其中存在一个突变位点, 即2289位点T变成了C(T2289C),No.17(中度耐药株)共测出 278个碱基,其中存在2个突变位点,即G2224A、T2289C,No.22 (高度耐药株)共测出278


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