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LCM技术体系的建立及胃癌转移相关基因的筛查

王振宁  
【摘要】: 前言 转移是恶性肿瘤最显著的生物学特性之一,是决定肿瘤预后的关键因素。相对于肿瘤病因学而言,有关转移发生机制的研究起步较晚。肿瘤转移是一个多阶段、多基因调控的复杂病理过程,欲从分子水平了解其机制,就必须准确地分析癌细胞基因结构和表达的动态变化。但肿瘤组织是多种不同细胞群体相互作用的三维空间结构,混杂的正常细胞往往可能掩盖一些重要的遗传学特征,因此,细胞异质性已向传统分子病理学研究提出了挑战。激光捕获显微切割(LCM)是一项在显微镜下从组织切片中分离、纯化单一类型细胞群或单个细胞的新技术,可有效地地解决组织中的细胞异质性问题,是分子病理学和肿瘤基因组学研究的革命性技术。 胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,在西方国家,多数病例诊断时已届晚期,其5年生存率极低;在日本和中国,胃癌仍高居恶性肿瘤死亡率的第二位。侵袭和转移是进行期胃癌预后不良的主要原因。随着淋巴结清除术的规范和推广以及综合治疗新技术、新方法的问世,胃癌治疗效果有所提高,但对病期、生物学行为及亚临床转移的判定尚缺乏准确、有效的分子生物学指标,使现代外科治疗仍存在盲目性,因此,急需寻找能反映胃癌生物学行为的分子标志物,建立相应的分子分型标准,以指导外科治疗。 进行期胃癌根治术后5年生存率长期徘徊不前,其主要原因是术后腹膜复发转移达半数左右。这源于手术前已有癌细胞穿透浆膜或转移淋巴结被膜脱落入腹腔,日后形成播散转移。传统的细胞学检查预测和诊断腹膜微转移特异性较好,但敏感性偏低;癌胚抗原(CEA)mRNA检查虽敏感性有较大提高,但仍存在一定的假阳性和假阴性结果,因此,寻求新的特异性分子标志物具有十分重要的临床意义。 本研究首先建立并完善了LCM分子病理学技术体系,在此基础上筛查并确定了肝素酶、RhoC、存活素三种候选的肿瘤转移相关基因在胃癌演进、转移过程中的作用,继之,探讨以肝素酶和存活素mRNA检测腹腔游离癌细胞的灵敏性和特异性。 实验方法 1.利用LCM技术定量获取胃粘膜细胞和癌细胞,提取基因组DNA进 行高可信度全基因组DNA扩增(HF-WGAX分别检测产物中不同长度的 基因片段,以评价其扩增质量和效率。 2.利用LCM技术定量获取冰冻切片、乙醇或福尔马林固定的石蜡切片 中的胃癌细胞,提取DNA行全基因组DNA扩增,分别检测产物中不同长度 的基因片段;提取RNA,RT-PCR检测不同长度GAPDH基因CDNA片段, 以系统评价不同组织切片制备对LCM技术操作及后续的DNA、RNA分析 的影响。 3.收集我院肿瘤外科胃癌病例30例,均行淋巴结清除术,未接受手术 前放、化疗。每例分别切取正常胃粘膜、原发癌灶和转移淋巴结组织。对整 块组织行肝素酶特异性RT-PCR扩增的同时,应用LCM技术获取正常胃 粘膜细胞、原发灶癌细胞、转移淋巴结癌细胞,联合RT-PCR方法检测肝素 酶的表达,分析其与胃癌侵袭转移潜能的关系。 4.收集病例同3,联合LCM技术和半定量RT-PCR方法分析胃癌细 胞中RhQC基因表达水平与临床病理因素及侵袭转移潜能的关系。 5.收集病例同3,联合LCM技术和RT-PCR方法对比存活素基因在 正常胃粘膜、原发癌、转移癌细胞中表达率的变化,探讨其在.胃癌发生、发展 和转移过程中可能的作用。 6.利用凝胶电泳和RT-PCR技术比较新的RNAlater处理方法与常规 深低温保存对腹腔冲洗液中细胞RNA质量影响的差异,评价应用RNAlater 保存腹腔液细胞的可行性。 7.收集我院肿瘤外科手术病例48例,均行术中腹腔液检查,且未接受 手术前放、化疗。分别对腹腔液标本行肝素酶特异性引物RT-PCR扩增和 常规脱落细胞学检查,分析它们与胃癌临床病理因素及腹膜转移相关因素 的关系。 8·收集病例同7,对所得腹腔液标本行存活素特异性引物RT-PCR扩。 增,并探讨其与胃癌临床病理因素及腹膜转移相关因素的关系。 9.联合应用肝素酶mRNA、存活素mRNA和常规脱落细胞学三种检查 方法检测胃癌腹腔液中游离癌细胞,探讨其临床应用价值。 v·2· WWWWtw.W 结 果 1.LCM分子病理学技术体系的建立 LM200型LCM系统,经显微镜下定位,可以准确地将癌细胞从原发灶 或转移淋巴结中分离出来,并能计数获取的细胞数。 LC M结合HF-WGA技术,能达到1个细胞所得DNA可进行10次 PCR检测的水平,扩增产物中某些片段长度超过500hP。 冰冻切片和石蜡切片均能获得较满意的 LCM操作,结合


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