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寻常型银屑病患者皮损和血清中肿瘤坏死因子alpha及其受体的检测及其相关性研究

高奎斌  
【摘要】: 前言 银屑病以表皮角质形成细胞过度增生和淋巴细胞浸润为特征。免疫异常在其发病过程中起着重要作用。免疫调节主要是通过细胞因子相互作用来实现的,银屑病皮损和/或外周血存在TNF-α及其受体的异常。 研究表明,银屑病皮损TNF-α的免疫反应性和生物学活性明显升高。冻融的银屑病皮损上清液含有大量的TNF-α;角质形成细胞、血管内皮细胞和表皮树突状细胞上的粘附分子表达增高,角质形成细胞和真皮血管内皮细胞上的TNF-α表达增高,提示TNF-α可能通过干预银屑病皮损区粘附分子表达而参与银屑病的发生。然而,并不能在银屑病皮损内始终如一地检测到TNF-α。 TNF-α通过与其受体(TNFR)结合发挥其生物学效应。有报道银屑病皮损处表皮全层和真皮血管周围浸润细胞均表达TNFR-Ⅰ,并认为TNF-α可通过与TNFR-Ⅰ结合而作用于角质形成细胞等;银屑病皮损表皮不表达TNFR-Ⅱ,真皮内浸润炎性细胞表达TNFR-Ⅱ。随后的研究发现银屑病皮损表皮TNFR-Ⅰ的含量明显增高,TNFR-Ⅱ轻度增高,并认为TNF-α受体的局部或系统释放可能调节TNF-α的作用效果。可见TNFR-Ⅰ和TNFR-Ⅱ在银屑病皮损处的表达仍不十分明确。国内尚未见有关于TNF-α及其受体在银屑病皮损边缘外观正常皮肤表达与否的研究报道。 近年来,人们对银屑病患者外周血是否存在TNF-α及其受体的异常表达进行了研究,Gomi等检测21例寻常型银屑病患者血清TNF-α,结果表明TNF-α的水平无明显改变。随后的研究发现银屑病外周血TNF-α的血清水平明显升高。最近有人在对银屑病患者巨细胞病毒与TNF-α关系的研究中也观察到了血清TNF-α水平增高。上述研究结果提示外周血TNF-α可能参与了银屑病的发生。 外周血可溶性TNF-α受体(sTNFRs)对体内TNF-α的生物学活性起着重要的调节作用,但sTNFRs与银屑病方面的研究报道很少。近年来的研究发现银屑病血清sTNFR-Ⅰ的含量明显增高;还有报道关节病型银 屑病外周血TNF-a含量降低,sTNFR-I和sTNFR一见的活性上调。n- FRs参与免疫过程,sTNFRs浓度反映细胞免疫活性,与TNF-a和其它可 溶性免疫物质卜几一ZR)等密切相关。同时检测银屑病皮损和外周血TNF -。及其受体水平对于分析皮损局部与整体TNF-a及其受体变化的关系 非常必要。目前尚未见同时比较皮损局部与外周血TNF-a及其受体变化 的实验资料。 为此,本文应用兔疫组织化学方法对银屑病皮损、皮损边缘外观正常皮 肤TNF-a及其受体的表达进行研究;用 ELISA方法检测银屑病血清 TNF 一。及其受体含量,以探讨皮损和血清TNF-a及其受体在银屑病发生发 展中的作用。国内外尚未见银屑病皮损表皮TNF-。及其受体InRNA表达 与否的研究报道,本文应用RT—PCR方法检测寻常型银屑病患者皮损表皮 TNF—a及其受体的mRNA相对量,以探讨TNF-a及其受体mRNA对寻 常型银屑病皮损TNF-a及其受体的影响。 材料和方法 二.标本收集 O)患者诊断确认:所有寻常型银屑病患者均经临床和组织病理确诊。 收集47例病例的皮损47份,外周静脉血20份,并从外周静脉血中分高血 清20份。 p)献血员和正常对照:采集正常献血员外周静脉血20份,并从中分 高血清20份。收集整形外科手术切除的正常皮肤34份。 2.皮损中 TNF—a及其受体’YNFR—I和 TNFR一见的检测 分别以抗人 TNF-a、TNFR-I和 TNFR-11为一抗,采用免疫组织化 学方法对皮损和皮损边缘外观正常皮肤表皮及真皮内单一核细胞’I’NF一。 及其受体TNFR—I和TNFR-11的表达进行研究。 3.用EllSA法检测血清中TNF-a及其受体的含量 采用人TNF-。ELISA试剂盒检测银屑病患者血清中TNF-a,利用人 sTNFR ELISA试剂盒检测银屑病患者血清中 sTNFR-I和 sTNFR—11。 4.表皮RNA提取JNA纯度和浓度测定及其浓度的调定 O)真皮表皮分离:用inn-na’缓冲液剥离表皮。 ·2· p)以目前通用的TRIZOL方法提取正常人表皮和寻常型银屑病患者 皮损表皮总 RNA。 橱)提取的总RNA用紫外分光光度计测定260run和280urn的光密度 (ODX并根据此OD值计算RNA的浓度和纯度,用DEPC水调定RNA浓度 至 0.5 pg/汕 5.逆转录合成山NA 遵循 wmesa试剂盒的操作要求,取 z…(含二%nx)ns稀释液进 行逆转录。经变性和逆转录过程之后,将产物 CDNA按 1:4稀释并分装,一 20℃冻存,以供PCR使用。 6.引物设定 (l)p一actin内对照5!物 利用[me6引物设计软件涉tip:人。 g6。。帧.Mt.edVcgi- biatPrimer/Priltle6·c矽)设计内对照引物对:民/p卯 (2)TNF-a、TNFR一互和 TNFR-11弓物 本文采用已有文献报道的TNF-a、TNFR-I和TNFR-11片段为模 板设计 PCR弓物对:T;/TZ、11/IZ和几/*。 7·PCR扩增条件 采用20gi反应体系,其中含 10 x Biber【M4”reeX…,dNTP卜」 3.6…,MgCI*.二…,Taq DNA聚合酶0·4…,CDNA模板4PI,引物口2.5


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