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感觉神经肽与小儿支气管哮喘的临床及基础研究

尚云晓  
【摘要】: 前言 支气管哮喘是小儿常见的全球性、慢性肺部疾患,其患病率呈逐年增加趋势。小儿哮喘的发病机理极其复杂,一直是国际上的研究热点。对其机制的研究不仅有利于阐明哮喘的本质,而且有助于寻求新的预防治疗途径和方向。 现认为,哮喘是一种由嗜酸细胞为主的多种细胞和炎症介质共同参与的气道慢性炎症,气道高反应性是哮喘发病的重要基础。随着对气道炎症研究的深入,近年来,由肺内感觉神经末梢释放的感觉神经肽所介导的气道神经源性炎症日益受到重视,为探讨哮喘的发病机制开辟了一个新的途径。感觉神经肽是指存在于气道无髓鞘感觉神经中的神经肽,是气道非肾上腺素-非胆碱能神经(NANC)的重要递质。目前认为与哮喘关系较为密切且研究较多的有神经激肽A(NKA)、神经激肽B(NKB)和P物质(SP),当气道感觉神经末梢受某些因素刺激时,可通过轴突反射机制释放。目前对上述感觉神经肽的生物活性研究表明,它们具有收缩气道平滑肌、增加血浆外渗、促进粘液高分泌、促进炎症介质释放及增加气道高反应性等作用,因而认为它们与哮喘的关系密切,在气道释放后,可能参与哮喘的病理生理过程。 感觉神经肽可能参与哮喘的依据目前主要来自动物实验及体外研究,在小儿哮喘的临床研究国内外尚属空白。小儿哮喘时体内内源性感觉神经肽含量的动态变化、小儿哮喘时各种感觉神经肽之间的相互关系、哪些因素可促进(或抑制)感觉神经肽的分泌等尚不清楚,需要从不同角度、不同手段进 stw入研究。 本研究是在小儿哮喘临床研究的基础上,并结合动物哮喘模型进行多因 素、多水平的相关深入研究。利用免疫学方法检测血液、支气管肺泡灌洗液、 肺组织中NKA、N’KB及SP蛋白含量;采用原位杂交技柳RTM手段检 测感觉神经肽在肺组织中基因表达的分布及含量;研究烟雾、冷约、激素 对肺内感觉神经肽的影响等;柳究结果更为可靠。本研究不仅有助于阐明 各种感觉神经肽与哮喘的关系,而且将为采取何种手段控制气道的神经源性 炎症,寻求一)哮喘治疗途径奠定重要的理论及临床基础。 材料与方法 1.临床资料:哮喘患儿35例,年龄7月八 岁;其中<3岁16例,歹3 岁19例,为确诊后经系统治疗观察的我院住院患儿。小儿哮喘的诊断标准及 病情分度,以1998年全国儿科呼吸会议制定标准执行。哮喘组中属重度哮喘 18例;轻、中度哮喘17例,入院前一周内均无静脉及口服用激素史;对照 组为同龄健康儿15例,既往无哮喘、可疑哮喘及毛细支气管炎病史和哮喘家 族史。 2.动物模型:参照通用的Huson方法制作。将单只豚鼠置于半封闭的容” 器中,于第1,4,7天分别超声雾化吸入1%卵蛋白各3分钟使其致敏;第 21大超声雾化吸入二%卵蛋白 5分钟激发诱喘。对照组同期雾化吸入生理盐 对。 将同条件豚鼠按雌雄各半随机分成以下各组:①常规诱喘组(同上入②反复 诱喘组:第ZI天诱喘后,再反复隔日诱喘一次,连续一周;③正常对照组; ④吸烟 2周后诱喘组:在第 7天吸入 158 OYA后,每日吸入香烟雾 2小时, 连续三周,第对天诱喘;⑤诱喘后吸烟组:常规诱喘后,继续吸入细雾1 周;③诱喘后1周组:常规诱喘后饲养1周:③吸入冷空气组:常规诱喘后 继续吸入冷空气 1周,日 2次,各 I5minZ③吸入两酸倍氯米松组:常规瞄 效后豚鼠,于诱喘前1天、诱喘当大及取材当天,每日各吸入丙酸倍氯米松 雾化溶液2次,每次5。ik 3.标本采集及处理: 2 l)哮喘患儿于刚入院时的哮喘发作期及其治疗后的症状缓解期分别留取 8.oml静脉血,立即置于含EDTA和Aprotinin的预冷试管中,混匀,低温离 。心后,分高血浆于广0 oC存放待测。 2)待测 N’KA、NKB及 SP血浆标本经 SEPf C;。提纯后,真空冷冻抽 干至粉末,按药盒要求检测。 3)动物标本取材:常规诱喘后22.二4h内统一时间段取材(研究组与对 照组取材时间一致人 取材前以戊巴比妥腹腔注射麻醉。活体时留取BALF, 切断颈动脉取血(处理方法同人人以专用器械①.1%DEPC浸泡、高压灭菌) 取气管及肺组织,置无Rnase管中液氮冻存;另取部分组织用含DEPC的4% 多聚甲醛固定,制作石蜡切片。 4.实验方法· 1)血和肺组织中N’KA、NKB含量以ELISA方法检测,SP由放免5去检 测,肺组织检测前需按要求制成组织匀浆。组织蛋白定量用考马斯亮蓝法。 2人原位杂交检测:试剂盒采用针对N’KA,N’KB,SP的寡核苦酸探针, 经地高辛标记。在肺组织石蜡切片上原位显示NKA,NKB及SP的mRNA 表达。 3)RT一PCR叙定:用TRIZOL,总RNA提取试剂提取肺组织mRNA, 反转录合成。DNA第一链,分别扩增}似,N’KB,SP产物,检测肺组织中 NKA,NKB,SP e表达的相对含量。 5.结果判定及数据处理 1)NKA,NKB,SP的免疫学检测结果以天士S表示;肺组织匀浆结果需 除以其组织中的蛋白定量。用SPSS软件进行t检验(或配对t检验)及相关 性统计学分析。 2)N


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