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疟原虫(Plasmodium bergher)感染鼠PEC细胞IL-12p40基因表达抑制机制的研究

刘凤芝  
【摘要】: 人体的免疫功能分为先天和后天(获得)免疫。两者在发挥抗各种病原菌如细菌,寄生虫和病毒感染时,不同种类的淋巴因子具有重要的保护作用。正常情况下,病毒和细菌感染首先激活先天免疫,其次诱导Ⅰ型T细胞亚群。该T细胞认为是在IL-12的影响下,以抗原特异的方式被诱导的。细菌刺激活化天然免疫中的巨噬细胞和随后的NK细胞分别产生IL-12和IFN—γ,IL-12接着诱导NK细胞产生IFN—γ,IFN—γ依次又激活巨噬细胞将抗原提呈给抗原特异性T细胞,最终,天然免疫和与其相伴的抗原特异性T细胞反应共同将病原菌清除。所以IL-12对防御病原菌感染发挥了重要作用,并且是连接先天和后天免疫的关键分子。然而,IL-12的基因表达在某些感染如麻疹和利什曼原虫感染时却被抑制了。有报道疟原虫感染的红细胞抑制DC(Dendritic cells)的功能,并导致无法诱导Ⅰ型T细胞反应。在前期的研究中,我室曾报道了疟原虫感染鼠的腹腔渗出细胞(PEC)IL-12p40基因表达被抑制。这一观察促使我们去分析在疟原虫感染时诱导IL-12p40基因表达抑制的机制。分析IL-12p40基因表达的调节会使我们更好地利用病原菌感染时这一基因的作用。这将有利于预防和控制各种感染性疾病。 中文摘要 cells,PEC),用RT一PCR的方法测定未感染和感染疟原虫(P. be几劝ez’) 小鼠IL一12p4o的基因表达。实验结果表明:P. be几功ez’感染鼠的 1L一12p4o的mRNA表达明显低于P. be几劝ez’未感染鼠的表达。为了 方便比较某种因子在不同实验中mRNA的表达水平,我们用逐级稀释 的IL一12p4o和p一aetin DNA片段(或含有IL一12p40和p一aetin靶序列 的质粒pBlueseript)做模板,进行PeR扩增,PeR产物经电泳,成 像后,用专门软件测定各带强度,最后以稀释浓度的对数为横坐标, 各带的强度为纵坐标在半对数纸上做曲线。结果,两条直线基本平行。 这样,可选择p一actin作为测定各因子mRNA表达的参照标准,既半 定量RT一PCR。我们用这一方法也检测了P. be几劝ez’未感染鼠和 P. be几功e1’感染鼠的IL一12p4o,IL一12p35的mRNA表达。发现,IL一12p35 的mRNA表达未受感染影响。说明工L一1 Zp4o和工L一1 2p35的基因表达 是被分别地调节。 第二部分 疟原虫(Pla~dz’姗beI.ghez’)感染鼠PEC细胞IL一12p40基因 表达抑制机制的研究(1) —从PEC细胞水平的研究 为探讨P. be乓劝ez’感染鼠PEC细胞工L一12p40基因表达抑制机制, 首先要了解是否PEC细胞吞噬了P. beZ若力e了感染的红细胞。用红内期 的疟原虫经腹腔感染小鼠一天后的PEC细胞进行常规姬姆萨染色,并 对其光镜下观察。发现只有少数PEC细胞吞噬了疟原虫感染的红细 胞。 尽管疟原虫未直接感染PEC细胞,但PEC细胞却由于感染而深受 影响。为了解哪种细胞与观察到的抑制有关,我们采用了细胞组合实 验。将未感染和感染P.be了沙ez’的PEC细胞以不同比例组合,在组织 培养板上培养24小时。贴壁的细胞进一步用LPS加工FN一Y刺激培养。 然后,测定1L一12p4OmRNA的表达。结果表明:未感染和感染PEC以 1:1比例混合后的工L一12p40mRNA的表达水平低于未感染和感染PEC 组工L一12p40mRNA表达水平的平均值。说明性罗业经沸肚近故 细胞间工L一12p4o基因表达的抑制韭用。 中文摘要 由于AdPEC细胞在细胞间抑制作用中扮演了重要角色,因此有 必要对AdPEC细胞表面分子作进一步分析。用EDTA处理贴壁的AdPEC 细胞,并洗涤搜集。用抗CD 1 lb,eD 1 IC,CD4O,CDSO和CD86的FITC- 结合的抗体染色后,用流式细胞仪分析。结果表明:多数AdPEC细 胞是CDllb阳性,少数AdPEC细胞是CDlle阳性。这表明,多数AdPEC 细胞是巨噬细胞,少数AdPEC细胞是树突状细胞(DC)。感染PEC表 达的CD86分子高于未感染PEC。两种PEC细胞也表达CD4O,CDSO和 CD86分子。CD4O和CDSO在两种PEC细胞表达水平接近,但CD86分 子的表达在P. be增力ej感染的AdPEC细胞高于未感染的AdPEC细胞。 第三部分 疟原虫(Pla~dz’姗be乓功ez’)感染鼠PEC细胞IL一1 2p40基因 表达抑制机制的研究(2) —从IL一12相关细胞因子及核因子水平研究 IL一12p40的表达受多种细胞因子及核因子的调节。我们采用半 定量RT一PCR的方法对相关细胞因子工L一10、TGF一pl和TGF一解;核因 子工RF一1和NF一KB的mRNA水平进行了分析。发现在P. be几劝ez’感染 的PEC细胞,经LPS和IFN一Y刺激培养后,TGF一印和TGF一pZ表达 受抑,TGF一即表达抑制更加明显。相反,P. bel爸的ez’感染的PEC细胞, 经LPS和IFN一Y刺激培养后,工L一10的表达明显增强。由于LPS和 IFN一Y刺激培养的PEC细胞工L一12p40基因的表达需要转录因子工RF一1 和NF一KB,而诩0S的基因表达也需要工RF一1和NF一KB。因此,未感 染和感染P. beZ勃ez’的PEC细胞的RT一PCR产物,在测定IL一12p4o, IL一10,TGF一pl和TGF一p 2 mRNA表达的同时,对iNOS和IRF一1 mRNA 的表达进行了测定。结果表明:在未感染和P. be几劝ez’感?


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